амплификация что это в медицине
ПЦР-диагностика
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).
Принцип ПЦР- исследования
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?
Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.
Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.
Как это все происходит в лаборатории
Выделение ДНК
Элонгация
Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.
Детекция
Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:
Преимущества методики ПЦР
Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).
Области применения в медицине
В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:
Амплификация что это в медицине
Кроме транслокаций и других перестроек, при многих опухолях наблюдают другое цитогенетическое нарушение — амплификацию генов, ситуацию, когда в клетке появляется множество дополнительных копий сегмента генома. Амплификация генов часто встречается при многих опухолях, включая нейробластомы, сквамозноклеточный рак головы и шеи, колоректальные раки и злокачественные глиобластомы мозга.
Амплифицированные сегменты ДНК легко обнаружить при CGH, они проявляются как два типа цитогенетических изменений при обычном хромосомном анализе: двойные маркеры (очень небольшие дополнительные хромосомы) и гомогенно окрашивающиеся регионы, не имеющие нормальных бендов и содержащие многочисленные амплифицированные копии конкретного сегмента ДНК.
Как и почему появляются двойные маркеры и гомогенно окрашиваемые регионы, полного понимания нет, но известно, что амплифицированные регионы включают дополнительные копии протоонкогенов, такие как гены, кодирующие Мус, Ras, и рецептор эпителиального фактора роста, который стимулирует рост клеток или блокирует апоптоз, или и то другое сразу. Например, амплификация протоонкогена MYCN, кодирующего белок N-Myc — важный клинический прогностический показатель детской нейробластомы.
MYCN увеличивается более чем в 200 раз в 40% случаев на поздних стадиях развития нейробластом; несмотря на агрессивное лечение, только у 30% больных на поздней стадии выживаемость составляет более 3 лет. В отличие от этого, амплификацию MYCN обнаруживают только в 4% нейробластом на ранних стадиях, и 3-летняя выживаемость достигает 90%. Амплификация генов, кодирующих субстраты химиотерапевтических препаратов, также участвует в развитии резистентности к лекарствам у пациентов, ранее получавших химиотерапевтическое лечение.
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
— Вернуться в содержание раздела «генетика» на нашем сайте
Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!
Амплификации в опухоли
Амплификация генов — нарушение синтеза дочерних молекул ДНК, при котором вместо одной копии того или иного участка хромосомы образуется множество. Процесс представляет собой мутацию (один из вариантов хромосомных перестроек) — изменение их структуры и вызванные им внешние проявления.
Процесс амплификации генов часто происходит в клетках опухолей и никогда не встречается в нормальных. Если на амплифицированном участке находится ген, стимулирующий формирование и рост злокачественных новообразований (онкоген), это вызывает неконтролируемый рост атипичной ткани.
Примеры амплификации в опухоли
При исследованиях опухолей выявлен ряд закономерных амплификаций известных онкогенов:
Клиническая значимость амплификации в опухоли
Амплификация в ДНК опухоли повышает устойчивость раковых клеток к фармако- и химиотерапии. К примеру, при лечении метотрексатом, угнетающим активность дигидрофолатредуктазы, нередко появляются атипичные клетки, у которых этот фермент закодирован.
Амплификация в опухоли, как правило, повышает агрессивность течения заболевания: повышает число рецидивов, сокращает безрецидивный интервал, свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для жизни пациента. В подобных случаях по возможности используют таргетную терапию. При её проведении специфическими препаратами воздействуют на рецепторы онкогенов и подавляют их активность. Метод доказал свою эффективность в лечении ERBB2-амплифицированного рака молочной железы препаратом «Герцептин».
Степень амплификации (количественные изменения онкогенов) коррелирует со стадией развития опухоли.
Методы исследований амплификаций в опухоли
Для исследования количественных и качественных изменений в клетках при амплификации опухолей используют следующие методы:
Наряду с перечисленными исследованиями с помощью генетических маркеров определяют предрасположенность к тому или иному виду рака. Результаты комплексной молекулярной диагностики позволяют выбирать оптимальную терапевтическую тактику при амплификации в опухоли.
Амплификация что это в медицине
ГБУ Ростовской области «Патологоанатомическое бюро», Ростов-на-Дону
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России
ГБУ Ростовской области «Патологоанатомическое бюро», Ростов-на-Дону
Амплификация гена как механизм возникновения клональной гетерогенности при раке молочной железы
Журнал: Архив патологии. 2019;81(6): 49-55
Павленко И. А., Завалишина Л. Э., Повилайтите П. Е. Амплификация гена как механизм возникновения клональной гетерогенности при раке молочной железы. Архив патологии. 2019;81(6):49-55.
Pavlenko I A, Zavalishina L É, Povilaĭtite P E. gene amplification as a mechanism of clonal heterogeneity in breast cancer. Arkhiv Patologii. 2019;81(6):49-55.
https://doi.org/10.17116/patol20198106149
ГБУ Ростовской области «Патологоанатомическое бюро», Ростов-на-Дону
Цель исследования — оценить выраженность гетерогенности амплификации гена HER2/neu при раке молочной железы (РМЖ) с положительным HER2/neu-статусом. Материал и методы. В образцах РМЖ с иммуногистохимической оценкой экспрессии HER2/neu2+ оценивали амплификацию гена HER2/neu и соотношение HER2/CEP17 методом FISH. Интерпретацию результатов проводили согласно рекомендациям ASCO/CAP2018г. РМЖ с наличием амплификации HER2/neu (n=25) оценивали на предмет вариабельности амплификации HER2/neu и HER2/CEP17 в учтенных при методе FISH 20 опухолевых клетках. Результаты. Обнаружена существенная внутриопухолевая вариабельность количества копий HER2/neu и показателя HER2/CEP17. В 28% исследованных образцов с положительным HER2/neu-статусом присутствовали клетки с отрицательным HER2/neu-статусом в количестве 5—15%. Для этих опухолей показатели количества копий гена HER2/neu и соотношения HER2/CEP17 были статистически значимо ниже, чем в группе, в которой все учтенные клетки характеризовались наличием амплификации HER2/neu: 6,25 (95% ДИ 4,3—12,45; p=0,0166) и 2,37 (95% ДИ 2,06—3,43; p=0,0076) соответственно. Пороговое значение HER2/CEP17, при котором в опухоли c положительным HER2/neu-статусом обнаруживаются клетки без амплификации, — 2,5. Заключение. Амплификация HER2/neu при РМЖ чрезвычайно вариабельна как в пределах одной опухоли, так и между опухолями одного биологического подтипа. Гетерогенность амплификации статистически значимо чаще присутствует в HER2/neu-положительных РМЖ с соотношением HER2/CEP17
Введение
Современная онкология рассматривает HER2/neu как важное звено патогенеза развития рака молочной железы (РМЖ) [1]. Точечные мутации этого гена встречаются редко, однако амплификация наблюдается приблизительно в 15% случаев РМЖ. Опухоли с амплификацией HER2/neu, или HER2/neu-положительные РМЖ принадлежат к двум молекулярно-генетическим подтипам РМЖ: люминальному В- и HER2 (+)-подтипу [2].
Хорошо известно, что HER2-положительные РМЖ при отсутствии терапии характеризуются агрессивным течением, ранним метастазированием, низкой безрецидивной и общей выживаемостью [1, 2]. Таргетная (target — мишень) терапия гуманизированными моноклональными антителами к белку HER2/neu, такими как трастузумаб и пертузумаб, значительно увеличивает частоту полных патоморфологических регрессий опухолей, снижает риск рецидива, прогрессии и смерти от заболевания [3]. Прорыв в лечении HER2/neu-положительных опухолей привел к тому, что общепринятым методом оценки чувствительности к таргетной терапии стало определение статуса HER2/neu в рамках первичной диагностики РМЖ. На первом этапе HER2/neu-тестирования проводится скрининговое иммуногистохимическое (ИГХ) исследование экспрессии HER2. Результаты ИГХ-реакции оценивают в баллах от 0 до 3+. Опухоли с оценками 0 и 1+ считаются негативными и не подлежат лечению таргетными препаратами, 2+ имеют неопределенный результат, требующий проведения исследования амплификации гена HER2/neu с помощью гибридизации in situ (ISH), 3+ – HER2/neu-положительные опухоли. На следующем этапе проводится определение амплификации гена HER2/neu методом ISH (fluorescence in situ hybridization — FISH или его аналогами). При подтвержденной амплификации HER2/neu (в случаях, когда ИГХ-исследование опухоли дало оценку 3+ или амплификация гена была определена методом ISH) больным показано назначение одного из вариантов таргетной терапии с использованием различных анти-HER2/neu-препаратов. Стандарты HER2/neu-тестирования, в которых прописан четкий алгоритм его проведения и интерпретации результатов, изложены в рекомендациях Американского общества клинической онкологии и Коллегии американских патологов (ASCO/CAP) [4]. Рекомендации ASCO/CAP корректируются раз в несколько лет, если новые исследования дают основания к пересмотру этого документа. Так, например, по сравнению с рекомендациями ASCO/CAP 2013 г. [5] обновленные рекомендации 2018 г. коснулись достаточно редко встречающихся, но сложных для однозначной трактовки результатов ISH. Алгоритм HER2/neu-тестирования изменился в следующих случаях, если при ISH:
— соотношение HER2/CEP17 ≥2 и среднее количество копий гена HER2/neu 
Рис. 1. Вариабельность количества копий гена HER2/neu у пациентов с амплификацией HER2/neu (n=25). Каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует подсчитанному значению HER2/neu в одном опухолевом ядре. 
Рис. 3. Вариабельность отношения HER2/CEP17 у пациентов с амплификацией HER2/neu (n=25). Каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует вычисленному значению HER2/CEP17 в одном опухолевом ядре. графики значений медиан и 95% ДИ (рис. 2, 4). 
Рис. 2. Медианы и 95% доверительные интервалы количества копий гена HER2/neu в каждом опухолевом ядре (n=20) образцов РМЖ с амплификацией HER2/neu. 
Рис. 4. Медианы и 95% доверительные интервалы соотношения HER2/CEP17 в каждом опухолевом ядре (n=20) образцов РМЖ с амплификацией HER2/neu. На диаграмме рассеяния количества копий гена HER2/neu очевидны не только значительная вариабельность этого показателя в каждой конкретной опухоли, но и отличия опухолей друг от друга (см. рис. 1). Лишь в опухолях нескольких пациентов расположение точек (каждая точка соответствует подсчитанному значению HER2/neu в одном опухолевом ядре) на диаграмме достаточно компактное. То же самое наблюдается в отношении HER2/CEP17 (см. рис. 3). На графиках значений медиан и 95% ДИ (см. рис. 2, 4) точками обозначены медианные показатели HER2/neu и HER2/CEP17, а «усы» обозначают границы 95% ДИ и почти всегда асимметричны, что указывает на отклонение распределения признаков от нормального. Ширина 95% ДИ (размах «усов») свидетельствует о большой вариативности показателей. Существенные отличия количества копий гена HER2/neu между опухолевыми клетками, находящимися в непосредственной близости друг от друга, отмечены многими исследователями [8, 12, 13]. Наиболее вероятное объяснение такой неоднородности амплификации HER2/neu — повторяющиеся BFB-циклы (Breakage-Fusion-Bridge), лежащие в основе механизма амплификации генов. Каждый BFB-цикл начинается с двухцепочечного разрыва ДНК с последующим образованием нестабильной дицентрической хромосомы, в которой во время анафазы митоза происходит следующий двухцепочечный разрыв [14]. Поскольку количество таких разрывов, как и самих BFB-циклов, в каждой клетке абсолютно случайно, это приводит к вариабельности амплификации, визуально определяющейся методом FISH.
На графиках обращает на себя внимание не только тот факт, что 95% ДИ демонстрируют широкую вариабельность показателей, но и то, что в ряде случаев 95% ДИ вообще не перекрываются друг с другом. Это может указывать на статистически значимые различия между группами. Действительно, при сравнении медианных значений 25 групп между собой с помощью критерия Краскела—Уоллиса установлены достоверные различия как между количеством копий HER2/neu, так и соотношением HER2/CEP17 у разных пациентов (Н(24)=232,4; р –(3,2—1,3 x )), где у — вероятность наличия в HER2-положительной опухоли клеток без амплификации, х — среднее значение отношения HER2/CEP17 в 20 клетках этой опухоли. Данная зависимость статистически значима: критерий отношения правдоподобия G(1) = 3,8942; р=0,00485.
Пороговое значение HER2/CEP17, при котором в опухоли c положительным HER2/neu-статусом обнаруживаются клетки без амплификации (не важно, в каком количестве), составляет 2,5. Так как во всех проанализированных РМЖ отношение HER2/CEP17 ≥2, а количество копий гена HER2/neu ≥4 (в большинстве случаев 6 и более), они, бесспорно, относятся к категории HER2/neu-положительных, при этом больным показана наиболее эффективная для них таргетная терапия. Однако является ли феномен неоднородности амплификации клинически незначимым?
Применение таргетной терапии при РМЖ — один из великолепных примеров успеха персонализированной медицины и огромный прорыв в онкологии. Использование таргетных препаратов существенно ограничено первичной или приобретенной резистентностью, в основе которой лежит множество факторов, в том числе и генетическая гетерогенность опухоли. Существование генетической гетерогенности — пространственной и временно́й — отличительная черта РМЖ, что отмечается во многих исследованиях [9, 15, 16]. Вероятно, появление нескольких субклонов в пределах одной опухоли является одним из способов изменения ее злокачественного потенциала [17]. В нескольких ретроспективных исследованиях показано, что гетерогенные РМЖ ассоциированы с плохим прогнозом [18, 19]. Авторы объясняют прогрессию заболевания существованием резистентных к терапии субклонов опухоли, получающих конкурентное преимущество на фоне проводимого лечения. Поэтому определение и характеристика таких клонов имеют не только научный интерес, но и непосредственное отношение к прогнозу течения и выбору тактики лечения заболевания.
Определение мутационного статуса различных субклонов опухолей, которое стало возможным благодаря появлению методов полногеномной амплификации и секвенирования нового поколения, убедительно продемонстрировало существование в каждом из них совершенно особых генетических аберраций. Так, клетки без амплификации HER2/neu могут отличаться наличием амплификации других генов — BRF2(8p11-p12) и DSN1(20q13), а также соматическими мутациями HER2/neu [7]. Мутации PIK3CA в HER2/neu-положительных РМЖ с гетерогенной экспрессией HER2/neu также встречаются в тех клетках, где амплификации HER2/neu не наблюдается [20]. Клиническое значение обнаружения этих генетических аберраций пока неясно, но то, что различия между опухолями с разной долей HER2/neu—отрицательных опухолевых клеток в основной популяции с амплификацией HER2/neu существуют, продемонстрировано в нескольких работах. Так, например, показано, что РМЖ с высокой вариабельностью количества копий гена HER2/neu и присутствием клеток без амплификации на фоне доминантной HER2/neu-положительной опухоли имеют более высокий риск прогрессии и развития отдаленных метастазов по сравнению с гомогенными по амплификации HER2/neu-положительными опухолями, а также опухолями с отрицательным HER2/neu-статусом [21]. Эти РМЖ, по-видимому, очень близки описанным M. Ballard и соавт. [22] опухолям с «неклассическими» результатами FISH. Авторы отнесли к ним среди прочих РМЖ с низкой амплификацией, а именно те опухоли, которые при соотношении HER2/CEP17 ≥2 имеют среднее количество копий гена HER2 на ядро от 4 до 6. Проанализировав данные 8000 пациентов, исследователи обнаружили, что время до прогрессирования таких опухолей статистически значимо меньше, чем опухолей с «классической» амплификацией.
Следует отметить, что градации низкой амплификации отличаются в разных исследованиях. Например, в работе А. Borley и соавт. [23] это опухоли с количеством копий гена HER2/neu на клетку от 6 до 12. Авторы отмечают, что они резистентны к таргетной терапии в адъювантном режиме и имеют плохой прогноз по сравнению с РМЖ с более высоким количеством копий HER2/neu. Анализируемая выборка при соотношении HER2/CEP17 ≥2 содержит 6,25 (95% ДИ 4,3—12,45) копии гена HER2/neu на ядро, т. е. соответствует описанным в исследовании [23] опухолям с низкой амплификацией. Хотя причины неэффективности терапии авторами в этой работе не обсуждаются, считаем, что гетерогенность амплификации HER2/neu может играть здесь определенную роль. Амплификация HER2/neu, вероятно, вносит значительный вклад в появление опухолевых клонов de novo, генетическое и клональное разнообразие РМЖ. Таргетная анти-HER2/neu-терапия, действуя на чувствительные к ней HER2/neu-позитивные клетки, может способствовать селективному отбору минорных субклонов с отрицательным HER2/neu-статусом и прогрессии заболевания. В случаях, которые ранее интерпретировались как неопределенные в отношении амплификации HER2/neu (согласно рекомендациям ASCO/CAP, 2013), гетерогенность амплификации, возможно, выражена гораздо сильнее, чем в опухолях с положительным HER2/neu-статусом.
Заключение
Таким образом, амплификация HER2/neu при РМЖ чрезвычайно вариабельна как в пределах одной опухоли, так и между опухолями одного биологического подтипа. Более того, наличие в образце опухоли клона с амплификацией HER2/neu не исключает присутствия минорных субклонов с отрицательным HER2/neu-статусом, которым могут быть присущи другие генетические аберрации. Если при FISH-исследовании с двойной флюоресцентной меткой обнаружена амплификация гена HER2/neu и при этом соотношение HER2/CEP17 составляет 2≤ HER2/CEP17