Что такое микробиологическая лаборатория

Оснащение микробиологической лаборатории: от рабочего места «классического» микробиолога до новейших экспресс-систем детекции микроорганизмов

Применение лабораторных методов исследования является одним из ключевых аспектов идентификации микроорганизмов. В арсенале специалистов в настоящее время есть разнообразные методы лабораторной диагностики: как классические, так и новейшие, появившиеся в последние десятилетия и нашедшие широкое применение в практике.

Все большее внимание уделяется микробиологическим анализаторам, позволяющим использовать их для детекции патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, проводить их видовую идентификацию, оценивать чувствительность к антимикробным препаратам. Такое оборудование позволяет автоматизировать и упростить работу микробиолога, сократить наиболее трудоемкие этапы исследования в лаборатории и оперативно получить результаты.

Всё более востребованными становятся, такие методы как масс-спектрометрия, полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование, фрагментация генома и анализ спектра фрагментов, гибридизация на микрочипах и т.п.

В настоящее время из молекулярно-генетических методов исследования наиболее широкое применение занимает ПЦР «в реальном времени», которая благодаря появлению доступных и удобных в использовании приборов (QuantStudio 5 Thermo FS) завоевала прочное место в повседневной работе лабораторий. В основе ПЦР лежит процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro, с детекцией продуктов амплификации. Анализаторы на основе ПЦР метода сокращают время анализа, обеспечивают высокую надежность регистрации результатов и упрощают организацию работы лаборатории, в целом. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР нашел широкое применение в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарных службах и других отраслях для детекции и идентификации микроорганизмов, вирусов, в том числе в продуктах питания и растительных материалах, для детекции ГМО.

В последнее десятилетие технология секвенирования внесла большой вклад в развитие современной микробиологии. Секвенирование используется для надежной идентификации любого микроорганизма, изучения факторов патогенности или адаптации на генном уровне, разработки методов генной инженерии, оценки биологического разнообразия микробного сообщества без культивирования. Метод секвенирования (Ion GeneStudio S5) в настоящее время нашел еще одно применение в решении прикладной задачи пищевой отрасли – определение видовой оценки качества сырья и готового продукта для подтверждением его происхождения.

Несмотря на появление новейших методов диагностики микроорганизмов, классические микробиологические методы исследований являются по-прежнему «золотым стандартом» практически в каждой бактериологической лаборатории.

Бактериологические лаборатории организуются при больницах, санитарно-эпидемиологических станциях, ветеринарных службах, на производственных предприятиях, в научных учреждениях, различных проверяющих организациях. Как правило, при бактериологической лаборатории имеются: средоварочная, моечная, препараторская, стерилизационная. Оборудование в бактериологических лабораториях должно быть приспособлено для выполнения исследований в чистых условиях, предупреждающих персонал от возможного заражения. Помимо общелабораторного оборудования, на каждом рабочем месте должны быть: спиртовая или газовая горелки, штативы для пробирок, чашек Петри, вата, ерши для мытья посуды, бактериальные петли, серологические пипетки, пипетки Пастера, пинцеты, ножницы, скальпель, предметные и покровные стекла. В бактериологической лаборатории должны находиться металлические ведра или пакеты для утилизации использованной посуды. Кроме обычной лабораторной посуды, бактериологические лаборатории дополнительно снабжаются специальными видами посуды: чашки Петри для выращивания бактерий на плотных средах, качалочные колбы и мешки. Необходимы также резиновые груши для забора в пипетки исследуемый образец. Бактериологическая посуда должна быть чисто вымыта, стерилизована термообработкой и закрыта стерильными целлюлозными пробками. Важнейшими для бактериологической лаборатории являются инструменты для посевов микроорганизмов: бактерильные петли, пастеровские пипетки, стеклянные и платиновые шпатели. Для проведения посевов в асептических условиях бактериологические лаборатории оснащаются специальными застекленными боксами, оборудованными ультрафиолетовыми лампами. Бактериологической лаборатории необходимы: холодильник для хранения бактериальных культур, сывороток и других биологических субстратов, микроскоп с осветителем, центрифуга, термостаты с нагревом или с охлаждением для выращивания бактерий, аппарат для встряхивания различных смесей, автоклав и сухожаровой стерилизатор (сушильный шкаф) для стерилизации питательных сред, посуды и электрические стерилизаторы.

Источник

Часть I. Общая микробиология

Микробиологические лаборатории организуются при больницах, поликлиниках и санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС).

Материалом для микробиологических исследований служат чаще всего выделения человека (испражнения, моча, рвотные массы, мокрота, отделяемое ран), а также кровь, желчь, спинномозговая жидкость, промывные воды желудка, бронхов, трупный (секционный) материал и др.

Работа в микробиологической лаборатории с заразным материалом делает обязательным размещение ее в изолированном помещении. Для выполнения всех правил работы с заразным материалом и проведения микробиологических исследований лаборатория должна иметь несколько помещений:

Число лабораторных комнат определяется объемом работы лаборатории. В крупных лабораториях выделяют отдельные комнаты для работы с различными видами возбудителей.

Рабочий стол устанавливают у окна, чтобы свет падал сбоку или прямо. На столе размещают горелку, бактериологические петли, банки с дезинфицирующим раствором и ватой.

Внимание! Перед началом работы на столе размещают все необходимое для проведения исследования. Горелку устанавливают на расстоянии, равном предплечью работающего, т. е. в позиции, исключающей лишние движения во время работы. Размер пламени в горелке и правильное свечение регулируют до начала работы.

В термостате при проведении обычных исследований температура должна быть 37° С. В больших лабораториях может быть оборудована специальная термальная комната. Температуру ежедневно региструют.

В холодильнике держат некоторые питательные среды, диагностические препараты, кровь, желчь и пр.

Центрифугу используют для отделения плотных частиц от жидкости (например, эритроцитов от сыворотки).

В шкафах держат штативы, посуду, сухие питательные среды, реактивы и т. п.

Около раковины должны находиться сосуд с дезинфицирующим раствором для обработки рук и аптечка с набором предметов для оказания первой медицинской помощи.

Внимание! В боксе не разговаривают и избегают лишних движений.

Помещение для приготовления питательных сред должно находиться рядом с моечной и стерилизационной. В этой комнате должна быть раковина с подводкой горячей и холодной воды, дистиллятор, плита (газовая или электрическая), шкафы или стеллажи для хранения сухих питательных сред, химических реактивов, стерильной посуды.

В стерилизационной находятся приборы для стерилизации чистой посуды, питательных сред и обеззараживания отработанного материала: автоклавы, сушильный шкаф и др. (см. главу 5).

При наличии отдельной препараторской комнаты ее используют для подготовки, упаковки посуды и другой подсобной работы.

В регистратуре, или части помещения ее заменяющей, принимают и регистрируют материал, поступающий для исследования, и выдают заключения микробиологического исследования.

Правила поведения и работы в микробиологической лаборатории

1. К работе допускают сотрудников только после ознакомления с правилами поведения и режимом работы.

2. Все работники подвергаются профилактическим прививкам, главным образом против кишечных инфекций.

3. Каждый сотрудник имеет халат и шапочку; в лаборатории носят сменную обувь.

4. Каждый сотрудник обязан строго соблюдать личную гигиену, содержать в чистоте рабочее место.

5. Поступающий в лабораторию материал регистрируют в специальный журнал и маркируют.

6. Весь поступающий материал для исследования считают инфицированным (заразным). Его ставят на специальный поднос, а емкость с материалом протирают дезинфицирующим раствором снаружи.

7. Переливать исследуемый материал из одной емкости в другую следует над дезинфицирующим раствором. Жидкий материал отсасывают с помощью резинового баллона, надетого на пипетку.

8. При попадании исследуемого материала на руки, стол или другие предметы их обрабатывают дезинфицирующим раствором.

9. По окончании работы руки, инструменты, рабочее место обрабатывают дезинфицирующим раствором. Культуры обезвреживают или, при необходимости, сохраняют в холодильнике, который опечатывают. Материал, требующий продолжения исследования, ставят в термостат, который тоже опечатывают. При хранении патогенных культур в лаборатории их регистрируют в специальном журнале. Указывают количество культур, даты их поступления, пересева, уничтожения.

10. В лаборатории категорически запрещается принимать пищу и курить.

11. В лаборатории ежедневно проводят влажную уборку помещений с применением дезинфицирующих растворов. Еженедельно моют стены, полы, инвентарь горячей водой с мылом. Бокс убирают в конце рабочего дня, а перед работой облучают бактерицидными лампами.

Режим работы в лабораториях зависит от степени опасности заражения для лиц, работающих с болезнетворными микроорганизмами или материалом, их содержащим.

Микроорганизмы по степени опасности заражения ими разделены на четыре группы:

I. Возбудители чумы.

II. Возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний (холера, бруцеллез, туляремия, сибирская язва, сап, мелиоидоз, лептоспироз).

III. Возбудители эпидемических бактериальных инфекций: кишечных (брюшной тиф, паратифы А и В, дизентерия), туберкулеза, дифтерии, коклюша, менингита, гонореи, листериоза, трахомы, лепры; патогенные анаэробы, спирохеты (возбудители эпидемического возвратного тифа и сифилиса) и др.

IV. Сальмонеллы, протей, эшерихии, клебсиеллы, гемоглобинофильные бактерии, стафилококки, стрептококки, возбудители газовой гангрены и др.

Большое значение для микробиологического исследования имеет техника взятия исследуемого материала и способ доставки его в лабораторию. Любой материал должен быть собран в стерильную посуду с соблюдением условий, предохраняющих его от загрязнения посторонней микрофлорой.

Испражнения берут специальной ректальной петлей, которую вводят в прямую кишку на 8-15 см. Петлю помещают в пробирку с консервантом (глицериновая смесь, фосфатно-буферная смесь и т. п.). Можно также использовать стерильные картонные тарелки или судно, обработанное дезинфицирующим раствором (10% хлорная известь) и тщательно промытое горячей водой для удаления следов хлорной извести.

Мочу берут стерильным катетером в стерильные флаконы или пробирки.

Гнойное отделяемое из раны, мазки из зева и носа берут стерильными ватными тампонами и помещают в стерильные пробирки. Рвотные массы собирают в стерильную широкогорлую банку, закрытую вощаной бумагой.

Трупный (секционный) материал следует брать в первые часы после смерти больного, так как микрофлора кишечника очень быстро распространяется по всему организму. Кровь из сердца берут стерильным шприцем, стерильными ножницами вырезают кусочки печени, селезенки и других органов. Все пробы для микробиологического исследования помещают в стерильные сосуды.

На пробирку, банку, флаконы с материалом для исследования наклеивают этикетку, на которой указаны фамилия, имя, отчество, возраст больного и дата взятия материала. В направлении повторяют сведения, приведенные на этикетке, и дополнительно сообщают: характер материала, учреждение, направившее материал, клинический диагноз, цель исследования и фамилию врача, направляющего материал.

Доставку исследуемого материала в лабораторию производят в кратчайший срок в специальных металлических биксах, контейнерах, пеналах. Материал, содержащий микроорганизмы, малоустойчивые во внешней среде, переносят в специальных сосудах, в которых поддерживается температура 37° С, при доставке вирусного материала используют термосы со льдом для создания низкой температуры.

Внимание! Правильный сбор и транспортировка исследуемого материала обеспечивают эффективность микробиологических исследований.

Методы микробиологического исследования

Микроскопический метод используется для изучения окрашенных мазков и мазков из нативного материала в микроскопе и позволяет характеризовать морфологию (форму) возбудителя, его отношение к различным красителям, подвижность. С помощью этого метода можно подтвердить клинический диагноз гонореи, дифтерии, возвратного тифа, сифилиса и некоторых других болезней.

Микробиологический метод применяют для выделения и изучения чистой культуры возбудителя, т. е. для установления этиологии заболевания. Лабораторная диагностика большинства инфекционных болезней (брюшной тиф, дизентерия, холера, коклюш и др.) основана на применении этого метода.

Контрольные вопросы

1. Каковы задачи микробиологической лаборатории?

2. Какие помещения имеет микробиологическая лаборатория?

3. Как следует вести себя при работе в микробиологической лаборатории?

4. Как собирают и пересылают в лабораторию материал для микробиологического исследования?

Источник

Что такое микробиологическая лаборатория

Актуальность вопроса

Микробиологическая, или бактериологическая лаборатория входит в состав клинико-диагностической лаборатории на базе научного или медицинского учреждения. Здесь проводят исследования, цель которых — выявить или опровергнуть наличие возбудителя в организме человека или в окружающей среде.

Поскольку сотрудники работают с патогенными микроорганизмами, микробиологическая лаборатория должна быть оснащена качественным, надёжным и функциональным оборудованием. Это гарантирует безопасность как персонала, так и окружающей среды.

Работа лаборатории регламентирована следующими документами: Приложением №9 «Стандарт оснащения клинико-диагностической лаборатории» к Приказу Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 16 марта 2010 г. №151н «Об утверждении порядка оказания медицинской помощи больным дерматовенерологического профиля и больных лепрой» (редакция от 29 сентября 2011 г.); Приказом Министерства здравоохранения РФ от 25.12.1997 г. №380 «О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях здравоохранения РФ».

Где открывать лабораторию

Бактериологическая лаборатория — это подразделение клинико-диагностической лаборатории (КДЛ). Работает на базе инфекционных больниц, стационаров (кожно-венерологических, туберкулёзных и пр.), больниц общего профиля.

Допускается организовать лабораторию либо в изолированной части учреждения, либо как автономный объект.

Общие требования к помещению

Вот ключевые требования, которые предъявляются к лаборатории.

Под неё отводят просторные, светлые помещения с выходящими на северную или северно-западную сторону окнами. Это объясняется тем, что лабораторные исследования лучше проводить при рассеянном свете.

Для покрытия пола подходит линолеум, стен — светлая масляная маска (красят стены на высоту 170 см).

Столы покрывают материалами, устойчивыми к дезинфицирующим средствам. Например, пластиком или стеклом.

В помещении обязательно проводят канализацию, горячее и холодное водоснабжение, отопление, вентиляцию и электричество. Также устанавливают раковины для мытья рук и посуды.

Также проводят сигнализацию, а на оконные проёмы ставят решётки.

Зонирование лаборатории

Помещение имеет две зоны. Первая — «чистая». Под неё выделяют несколько помещений:

Вторая зона — «заразная». Сотрудники работают с разными материалами, в том числе и заразными. Поэтому помещение, в котором ведутся такие работы, обязательно изолируют от остальных. Под эту зону выделяют такие помещения:

В лаборатории должно быть 2 входа для сотрудников.

Организация работы в асептических условиях

Чтобы гарантировать безопасность и исключить заражение и утечку патогенных микроорганизмов, в одном из помещений оборудуют застеклённый бокс. Здесь ставят лабораторный стол, табурет, бактерицидные лампы.

Бокс ограждают предбоксником, в котором устанавливают шкаф для хранения стерильных материалов.

Необходимое оборудование

Бактериологическую лабораторию оснащают таким оборудованием:

Данное оборудование позволит проводить полный комплекс исследований и предоставлять достоверные результаты.

Оснащение мебелью

Устанавливают специальную мебель, разработанную для лабораторий. Она отвечает потребностям сотрудников.

Предъявляются высокие требования к организации рабочего места лаборанта. Каждый сотрудник имеет персональное рабочее место. Столы ставят возле окна — это лучшее место для них. Причём нужно, чтобы свет падал слева или спереди. Недопустимо, чтобы свет падал из-за спины сотрудника. Столы должны быть освещены на 500 лк.

Площадь одного рабочего места — 150х60 см. Каждое из них оснащают инвентарём, который нужен сотрудникам ежедневно:

Также на рабочем месте ставят микроскопы и штативы.

Безопасность работников

Сотрудники исследуют очень опасные инфекции, поэтому так важно защитить их и окружающую среду. Для этого достаточно придерживаться ряда правил:

В зависимости от характера работы и возбудителей, подбирают костюмы и боксы определённого класса защиты.

Источник

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ

Введение

Все микробиологические, биохимические и моле-кулярно-биологические исследования микроорганизмов про­водят в специальных лабораториях, структура и оборудование которых зависят от объектов исследования (бактерий, вирусов, грибов, простейших), а также от их целевой направленности (научные исследования, диагностика заболеваний). Изучение иммунного ответа и серодиагностика заболеваний человека и животных осуществляют в иммунологических и серологичес­ких (serum — сыворотка крови) лабораториях.

Бактериологические, вирусологические, микологические и серологические (иммунологические) лаборатории входят в со­став санитарно-эпидемиологических станций (СЭС), диагнос­тических центров и крупных больниц. В лабораториях СЭС выполняют бактериологические, вирусологические и серологи­ческие анализы материалов, полученных от больных и контак­тировавших с ними лиц, обследуют бактерионосителей и про­водят санитарно-микробиологические исследования воды, воз­духа, почвы, пищевых продуктов и т.д.

В бактериологических и серологических лабораториях боль­ниц и диагностических центров проводят исследования с целью диагностики кишечных, гнойных, респираторных и дру­гих инфекционных заболеваний, осуществляют микробиологи­ческий контроль за стерилизацией и дезинфекцией.

Диагностику особо опасных инфекций (чума, туляремия, сибирская язва и др.) проводят в специальных режимных ла­бораториях, организация и порядок деятельности которых строго регламентированы.

В вирусологических лабораториях диагностируют заболева­ния, вызванные вирусами (грипп, гепатит, полиомиелит и др.), некоторыми бактериями — хламидиями (орнитоз и др.) и риккетсиями (сыпной тиф, Ку-лихорадка и др.). При организации и оборудовании вирусологических лабораторий учитывают спе­цифику работы с вирусами, культурами клеток и куриными эмбрионами, требующую строжайшей асептики.

В микологических лабораториях проводят диагностику за­болеваний, вызываемых патогенными грибами, возбудителями микозов.

Лаборатории обычно размещаются в нескольких помещени­ях, площадь которых определяется объемом работ и целевым назначением.

В каждой лаборатории предусмотрены:

а) боксы для работы с отдельными группами возбудителей;

б) помещения для серологических исследований;

в) помещения для мойки и стерилизации посуды, приготов­
ления питательных сред;

г) виварий с боксами для здоровых и подопытных живот­
ных;

д) регистратура для приема и выдачи анализов.

Наряду с этими помещениями в вирусологических лабора­ториях имеются боксы для специальной обработки исследуе­мого материала и работы с культурами клеток.

Оборудование микробиологических лабораторий

Лаборатории снабжены рядом обязательных приборов и аппаратов.

1. Приборы для микроскопии: биологический иммерсион­ный микроскоп с дополнительными приспособлениями (ос­ветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный кон­денсор и др.), люминесцентный микроскоп.

2. Термостаты и холодильники.

3. Приборы для приготовления питательных сред, растворов и т.д.: аппарат для получения дистиллированной воды (дистил­лятор), технические и аналитические весы, рН-метры, аппара­тура для фильтрования, водяные бани, центрифуги.

4. Набор инструментов для манипуляций с микробами: бак­териологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.

5. Лабораторная посуда: пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки и др., аппарат для изготовления ватно-марлевых про­бок.

Крупные диагностические комплексы имеют автоматичес­кие анализаторы и компьютеризированную систему оценки полученной информации.

В лаборатории выделено место для окраски микроскопичес­ких препаратов, где находятся растворы специальных красите­лей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой и емкостью с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми пита­тельными средами, химическими реактивами, диагностически­ми препаратами и другими материалами.

В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки се­рологических реакций. Для выращивания, хранения культур, стерилизации лабораторной посуды и других целей используют следующую аппаратуру.

1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоян­ная температура. Оптимальная температура для размножения большинства патогенных микроорганизмов 37 «С. Термостаты бывают воздушными и водяными.

2. Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорга­низмов в анаэробных условиях.

4. Холодильники. Используют в микробиологических лабора­ториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически актив­ных препаратов при температуре около 4 °С. Для хранения препаратов при температуре ниже О °С применяют низкотем­пературные холодильники, в которых поддерживается темпе­ратура —20 °С или —75 «С.

5. Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганиз­мов, эритроцитов и других клеток, для разделения неоднород­ных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях исполь­зуют центрифуги с различными режимами работы.

6. Сушилъно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Пред­назначен для суховоздушной стерилизации стеклянной лабо­раторной посуды и других жаростойких материалов.

7. Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для сте­рилизации перегретым водяным паром (под давлением). В ми­кробиологических лабораториях используют автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, пере­носные).

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ, МИКОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ. УСТРОЙСТВО СОВРЕМЕННЫХ МИКРОСКОПОВ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

1. Правила работы и организация микробиологических (бактериологических, вирусологических, микологи­ческих) лабораторий.

2. Основные приборы и оборудование микробиологичес­кой лаборатории.

3. Микроскопы и микроскопическая техника. Правила работы с иммерсионным микроскопом (объективами).

Демонстрация

1. Устройство и применение основных приборов и обо­рудования, используемого в микробиологических ла­бораториях: термостата, центрифуг, автоклава, су­шильного шкафа, инструментария и посуды.

2. Устройство биологического микроскопа. Различные ме­тоды микроскопии: темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная.

3. Препараты микробов (дрожжей и бактерий) при раз­личных методах микроскопии.

1. Микроскопировать и зарисовать препараты дрожже-подобных грибов рода Candida, используя различные виды микроскопии.

Методические указания

Правила работы в микробиологических лабораториях.

Работу в микробиологической лаборатории медицинского учреждения проводят с возбудителями инфекционных заболеваний — пато­генными микроорганизмами.

Поэтому для предохранения от заражения персонал обязан строго соблюдать правила внутрен­него распорядка:

1. Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых слу­чаях работающие надевают на лицо маску из марли. Ра­бота с особо опасными микробами регламентируется спе­циальной инструкцией и проводится в режимных лабора­ториях.

2. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

3. Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. Личные вещи сотрудников следует хранить в специально отведенном месте.

4. При случайном попадании инфицированного мате­риала на стол, пол и другие поверхности это место необ­ходимо тщательно обработать дезинфицирующим раство­ром.

5. Хранение, наблюдение за культурами микробов и их уничтожение должны производиться согласно специаль­ной инструкции. Культуры патогенных микробов реги­стрируют в специальном журнале.

6. По окончании работы руки следует тщательно вы­мыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

Микроскопы и методы микроскопии

а — общий вид микроскопа «Биолам»; б — микроскоп МБР-1: 1 — основание микроскопа; 2 — предметный столик; 3 — винты для перемещения предмет­ного столика; 4 — клеммы, прижимающие препарат; 5 — конденсор; 6 — кронштейн конденсора; 7 — винт, укрепляющий конденсор в гильзе; 8 — рукоятка перемещения конденсора; 9 — рукоятка ирисовой диафрагмы кон­денсора; 10 — зеркало; 11 — тубусодержатель; 12 — рукоятка макрометричес-кого винта; 13 — рукоятка микрометрического винта; 14 — револьвер объек­тивов; 15 — объективы; 16 — наклонный тубус; 17 — винт для крепления ту­буса; 18 — окуляр.

Для микробиологических исследований используют не­сколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (фа-зово-контрастный, темнопольный).

В микробиологической практике применяют микроскопы отечественных марок: МБР-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Био­лам» Р-1 и др. (рис. 1.1). Они предназначены для изучения формы, структуры, размеров и других признаков различных микробов, величина которых не менее 0,2—0,3 мкм.

Иммерсионная микроскопия

Применяется для увеличения разрешающей способности метода световой микроскопии. Раз­решающая способность системы светооптической микроско­пии определяется длиной волны видимого света и числовой апертурой системы. Числовая апертура показывает величину угла максимального конуса света, попадающего в объектив, и зависит от оптических свойств (преломляющей способности) среды между объектом и линзой объектива. Погружение объ­ектива в среду (минеральное масло, вода), имеющую высокий коэффициент преломления, близкий к таковому стекла, пре­пятствует рассеянию света от объекта.

Рис. 1.2. Ход лучей в иммерсионной системе, п — показатель преломления.

Рис. 1.3. Ход лучей в темнопольных конденсорах, а — параболоид-конденсор; б — кардиоид-конденсор; 1 — объектив; 2 — иммерсионное масло; 3 — препарат; 4 — зеркальная поверхность; 5 — диа­фрагма.

Таким образом достигается увеличение числовой апертуры и соответственно разре­шающей способности. Для иммерсионной микроскопии при­меняют специальные иммерсионные объективы, снабженные меткой (МИ — масляная иммерсия, ВИ — водная иммерсия). Предельная разрешающая способность иммерсионного микро­скопа не превышает 0,2 мкм. Ход лучей в иммерсионной системе показан на рис. 1.2.

Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, уве­личение микроскопа с иммерсионным объективом 90 и окуля­ром 10 составляет: 90 x 10 = 900.

Микроскопия в проходящем свете (светлопольная микроско­пия) используется для изучения окрашенных объектов в фик­сированных препаратах.

Темнопольная микроскопия. Применяется для прижизненно­го изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе (рис. 1.3). При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенном поле зрения) видны ярко светя­щиеся частицы. Препарат в этом случае имеет вид, показанный на рис. 1.4, б (на вклейке).

Фазово-контрастная микроскопия. Предназначена для изуче­ния нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособле­ние дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объек­ты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое глазом. Фазовое устройство, вклю­чающее особые конденсор и объектив, обеспечивает преобра­зование изменений фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различия в оптической плотности объектов. Они приобретают высокую контрастность, которая может быть позитивной или негатив­ной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изо­бражение объекта в светлом поле зрения, негативным — свет­лое изображение объекта на темном фоне (см. рис. 1.4; на вклейке).

Для фазово-контрастной микроскопии используют обыч­ный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устрой­ство КФ-1 или КФ-4 (рис. 1.5), а также специальные освети­тели.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Осно­вана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция — свечение веществ, возникающее под воздействием внешнего излучения: светового, ультрафиолето­вого, ионизирующего и др. Фотолюминесценция — люмине­сценция объекта под влиянием света. Если освещать люминес-цирующий объект синим светом, то он испускает лучи крас­ного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта.

Рис. 1.5. Фазово-контрастное устройство, а — фазовые объективы; б — вспомогательный микроскоп; в — фазовый кон­денсор.

Длина волны излучаемого света (цвет люминесценции) зависит от физико-хими­ческой структуры люминесцирующего вещества.

Первичная люминесценция биологических объектов (собст­венная, или биолюминесценция) наблюдается без предвари­тельного окрашивания за счет наличия собственных люминес-цирующих веществ, вторичная (наведенная) — возникает в ре­зультате окрашивания препаратов специальными люминесци-рующими красителями — флюорохромами (акридиновый оран­жевый, ауромин, корифосфин и др.). Люминесцентная микро­скопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследовать живые микробы и обнаруживать их в исследуемом материале в небольших кон­центрациях вследствие высокой степени контрастности.

В лабораторной практике люминесцентную микроскопию широко применяют для выявления и изучения многих микро­бов.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способнос­ти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяют для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других суб­микроскопических объектов. Световые лучи в таких микроско­пах заменяет поток электронов, имеющий при определенных ускорениях длину волны около 0,005 нм, т.е. почти в 100 000 раз меньше длины волны видимого света. Высокая разре­шающая способность электронного микроскопа, достигаю­щая 0,1-0,2 нм, позволяет получить общее полезное увеличе­ние до 1 000 000.

Наряду с приборами «просвечивающего» типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рель­ефное изображение поверхности объекта. Разрешающая спо­собность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов «просвечивающего» типа.

Правила работы с микроскопом

Работа с любым световым микроскопом включает установку правильного освещения по­ля зрения и препарата и его микроскопию различными объек­тивами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным, для чего используют специальные источники света — осветители разных марок.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка:

1) на приготовленный на предметном стекле и окрашенный мазок нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;

2) повернуть револьвер до отметки иммерсионного объек­тива 90х или 10Ох;

3) осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла;

4) установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;

5) провести окончательную фокусировку препарата микро­ метрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с пре­
паратом, так как это может повлечь поломку покровного стек­ла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1—1 мм).

По окончании работы микроскопа необходимо удалить мас­ло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив 8х.

Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии ис­пользуют нативные препараты («раздавленная» капля и др., см. тему 2.1); микроскопируют с объективом 40х или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85. Толщина предметных стекол не должна превышать 1 — 1,5 мм, покров­ных — 0,15—0,2 мм.

Источник