Что такое несигнатурный вирус
Неприятно познакомиться: как появились вирусы и почему в России их меньше, чем в Китае
В любой энциклопедии написано: «вирус» в переводе с латинского языка означает « яд». С тех пор как в XIX веке исследователи впервые столкнулись с заражением одного организма другим, знания о вирусах множились. К настоящему времени ученые изучили порядка пяти тысяч видов вирусов, но сказать, что науке доподлинно известно и с чем она имеет дело, нельзя. В двадцать первом веке все еще остаются вопросы, на которые у ученых-вирусологов нет ответов. Ведь количество неизученных вирусов, которые «свободно парят» вокруг нас, находятся в воде, земле, в организмах животных, в стеблях растений, исчисляется миллионами!
— За всю историю исследований в основном изучались вирусы человека и сельскохозяйственных животных, — поясняет «Вечерке» вирусолог, директор Института медицинской паразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний им. Е. И. Марциновского Сеченовского университета Александр Лукашев. — А вирусы есть у каждого вида живых существ на Земле, в том числе у грибов, мхов, бактерий, простейших. И многие могут перейти к человеку.
Когда и при каких условиях тому или иному вирусу приспичит активизироваться — вопрос, не поддающийся прогнозам. Точнее, «паразиты» бомбардируют все живое постоянно. Вирусная атака — это процесс в природе непрекращающийся. Ведь вирус не бактерия и не микроорганизм. Это фрагмент генетической информации, упакованный в белковую оболочку. У него нет клетки, а значит, вне живого организма он как бы не живет, а находится в замершем состоянии. Поэтому если вы спросите у специалиста, живые вирусы или нет, он ответит уклончиво: как бы нет, но в общем-то да. Делиться самостоятельно вирус не может, и чужая клетка нужна ему, чтобы жить.
— Любая живая информация старается выжить в биосфере, — говорит вирусолог Александр Лукашев. — Главная эволюционная задача вируса — не уничтожить живую клетку, а, используя ее ресурсы, размножиться как можно в большем количестве своих копий. У вируса нет задачи быть «плохим». Наоборот, «хороший» вирус имеет преимущества. Например, вирус герпеса большинству людей практически не наносит вреда. Им заражены все, он распространен повсеместно, и свою функцию — максимально размножиться — он выполняет. А, скажем, вирус Эболы убивает примерно половину своих жертв, и в том числе и поэтому он не может размножиться в популяции человека. С точки зрения эволюции убивать своего носителя вирусу невыгодно. Клеткам живых организмов приходится держать глухую оборону практически постоянно. Но человек и не знает, что находится под обстрелом фрагментов генетической информации, потому что в подавляющем большинстве случаев клетки самостоятельно разбираются с захватчиком, не допуская заражения. Только с воздухом мы вдыхаем едва ли не ежесекундно десятки вирусов, и ничего.
— Вирусы редко переходят между видами нечасто, — говорит вирусолог Александр Лукашев. — Скажем, вирусы от растений к животным переходят, наверное, раз в один миллион лет. Бомбардировка новых видов происходит постоянно, но чаще всего безуспешно. Легче перейти к близкому виду. Например, от приматов к человеку вирусы переходят много раз в год. От млекопитающих — примерно раз в 10 лет. Ту же Эболу человек подхватывает от летучих лисиц. И вспомним свиной грипп и другие «болячки», перешедшие от животных. Случаи могут регистрироваться, например, и два года подряд, а потом 20 лет будет затишье, но я говорю о средней периодичности. Но на каждый успешный переход приходится, условно, миллион безуспешных.
— Скученность населения и, скажем так, очень близкий контакт между людьми и животными — в Китае совпали все условия. Из-за особенностей пищевых рынков и, возможно, более высокой восприимчивости населения «чужой» вирус «зацепился», а дальше из-за высокой плотности китайского населения смог распространиться, — рассуждает вирусолог Александр Лукашев. — У нас в стране совсем другие условия, хотя известно, что зараженные примерно такими же опасными вирусами летучие мыши обитают на юге России. Кроме того, мы летучих мышей и панголинов не едим, не разделываем и на рынках не продаем, а значит, и попыток перейти от животного к человеку их вирус может предпринимать значительно меньше. Гипотетически же к человеку может перейти огромное число вирусов — умножьте число всех видов млекопитающих на 1000 и примерно узнаете, сколько. Но если нет условий, выгодных для распространения заразы, бояться нечего.
Вместе с тем наука признала, что вирусы — это наследие древнего мира, существовавшего до появления первой живой клетки, четыре миллиарда лет назад. Более того, из вирусов или их остатков по большей части состоит геном человека. Это значит, что они были основой развития жизни на Земле. Доказано, что человек, как млекопитающее, обязан существованием именно им, поскольку благодаря вирусам у наших предков начала формироваться плацента. Как? Они привнесли в человеческий геном белок, отвечающий за ее функцию. Кроме того, вирусы сильно повысили эффективность эволюции. Они переносили генетическую информацию намного эффективнее, чем это делалось только в ходе естественного размножения. То есть удачные гены они передавали не потомству вида, а сразу в новый организм.
Вирусы мутируют. Ученые говорят, что у многих из них каждый новый геном имеет дополнительную мутацию. Изменяется вирус иногда в течение нескольких часов. Внутри одной клетки, внутри одного цикла размножения одинаковых вирусов нет! Чтобы иметь возможность приспособиться к новым условиям, вирус меняется, производя в популяции самые разные варианты. Мутация для вирусов — обязательная часть их жизненного цикла. Собственный геном вирусов в миллион раз меньше человеческого, и чтобы с нами конкурировать, они мутируют, создавая множество вариантов, которые могут «пригодиться» в разных условиях.
Технологии несигнатурного детектирования
До миллиона потенциально вредоносных образцов поступает в сутки
в вирусную лабораторию «Доктор Веб».
Не всё пришедшее — вредоносные программы. Но все они должны быть обработаны нашими специалистами. Если добавлять знания о каждом новом троянце или вирусе сигнатурами — размер вирусной базы превысит все разумные размеры, и это будут знания только об известных вирусах. А их меньшинство!
Угроза заражения новейшим НЕИЗВЕСТНЫМ вирусом есть ВСЕГДА.
Технологически сложные и особо опасные вирусы, особенно созданные для извлечения коммерческой выгоды, вирусописатели проверяют на обнаружение по всем антивирусам перед тем, как выпустить такой вирус в «живую природу», чтобы вирус существовал незамеченным антивирусами как можно дольше. Поэтому всегда существует временная дельта между выпуском троянца злоумышленниками, попаданием его образца на анализ в вирусную лабораторию и изготовлением противоядия. До поступления образцов таких вирусов в лабораторию они не обнаруживаются ни одним антивирусом — если он использует только сигнатурные методы детектирования (например, бесплатные антивирусы).
Считается, что антивирус обязан обнаруживать
все вредоносные программы в момент их проникновения.
Только 30% вредоносного ПО обнаруживает сигнатурами современный антивирус.
Как Dr.Web обнаруживает еще 70% вредоносного ПО?
В продуктах Dr.Web для обнаружения и обезвреживания неизвестного вредоносного ПО применяется множество эффективных несигнатурных технологий, сочетание которых позволяет обнаруживать новейшие (неизвестные) угрозы до внесения записи в вирусную базу.
Эвристический анализатор
Обнаружение неизвестных вредоносных программ, на основании знаний (эвристики) об определенных особенностях (признаках) вирусов — как характерных именно для вирусного кода, так и, наоборот, крайне редко встречающихся в вирусах.
Эвристики обнаруживают только новые модификации ранее попавших на анализ вредоносных программ, с известным антивирусу поведением.
Технология Origins Tracing ™
Распознавание вирусов, еще не добавленных в вирусную базу Dr.Web, путем сканирования исполняемого файла, который рассматривается как некий образец, построенный характерным образом, и сравнения полученного образца с базой известных вредоносных программ.
Модуль эмуляции исполнения
Обнаружение полиморфных и сложношифрованных вирусов, когда непосредственное применение поиска по контрольным суммам невозможно либо крайне затруднено (из-за невозможности построения надежных сигнатур), путем имитации исполнения анализируемого кода эмулятором — программной моделью процессора (и отчасти компьютера и ОС).
Технология Fly-Code
Качественная проверка упакованных исполняемых объектов.
Распаковка любых (даже нестандартных) упаковщиков методом виртуализации исполнения файла.
Обнаружение вирусов, упакованных даже неизвестными антивирусному ПО Dr.Web упаковщиками.
Комплексный анализатор упакованных угроз
Значительное повышение уровня детектирования якобы «новых угроз» — известных вирусной базе Dr.Web, но скрытых под новыми упаковщиками.
Исключает необходимость добавления в вирусную базу все новых и новых записей об угрозах.
Технология Script Heuristic
Предотвращение исполнения любых вредоносных скриптов в браузере и PDF-документах без нарушения функциональности легитимных скриптов.
Защита от заражения неизвестными вирусами через веб-браузер.
Работа независимо от состояния вирусной базы Dr.Web совместно с любыми веб-браузерами.
Технология анализа структурной энтропии
Обнаружение неизвестных угроз по особенностям расположения участков кода в защищенных криптоупаковщиками проверяемых объектах.
Что такое «вирусы»?
Что представляют собой вирусы?
Вирусы — это мельчайшие частицы (от 15 до 3500 нм), своеобразные формы жизни, имеющие неклеточное строение, которые содержат собственный геном и способны размножаться только в клетках других организмов. Увидеть их можно в электронный микроскоп.
Впервые вирусные частицы были описаны Д. Ивановским (1892 г.) и М. Бейеринком (1898 г.). С тех пор их изучает отдельный раздел биологии – вирусология.
На настоящий момент считается, что вирусы — самая распространенная биологическая форма на Земле, насчитывающая около 100 млн. видов.
Обычно находятся они либо вне клеток (в покое), либо внутри их (вегетативная или репродуцирующая форма).
Ученые-биологи до сих пор спорят о том, что же такое вирусы, живые они или нет, разумные или не совсем.
Так как жить эти частицы могут только в чужих организмах, они являются паразитами. Встраивая свой генетический материал в клеточную структуру, они заставляют клетку воспроизводить себе подобных, разрушая её саму.
Вирион представляет собой комплекс нуклеиновой кислоты и белка (простые). В сложных есть еще и гликопротеиды. Снаружи находится оболочка – капсид, который защищает частицу от внешних воздействий и обеспечивает адсорбцию на нужных клетках-донорах. Он бывает спиральной, продолговатой, икосаэдрической и смешанной формы.
В зависимости от вида нуклеиновой кислоты, вирусы бывают РНК- и ДНК-содержащие.
Примеры первых: ротавирусы, ВИЧ, возбудители гепатита С, А и Е, гриппа, полиомиелита, бешенства, кори, лихорадки Эбола, ТОРС, коронавирусы (в частности, COVID-19) и др.
Ко вторым относятся: возбудители оспы, гепатита В, герпеса, папиллом и др.
Борьба с вирусами
Само название «вирус» в переводе с латыни обозначает «яд». И действительно, паразитируя в клетках других организмов, вирусы наносят им вред, заставляя работать на себя и, в конечном итоге, разрушая.
Находясь во внешней среде, эти зловредные сущности быстро погибают от сторонних воздействий: высокой температуры, солнечного света, дезсредств. Устойчивость к внешним факторам зависит от вида вируса. Например, при комнатной температуре возбудитель гепатита В живет до 3 месяцев, гепатита А — несколько недель.
При замораживании вирусы сохраняются месяцы, иногда даже годы.
Попадая в организм человека, животных или растений различными путями (воздушно-капельный, контактный, половой, алиментарный, через кровь), они поражают органы и ткани, вызывая различные заболевания.
Ученые научились использовать некоторые виды вирусов во благо человеку. Например, бактериофаги паразитируют в патогенных бактериях и ведут к их гибели, что помогает победить болезнь.
Вирусы обладают большой изменчивостью, что значительно затрудняет борьбу с ними.
Инфицированный организм обычно сам мобилизует свою иммунную систему для уничтожения вредных захватчиков.
Разрабатываются профилактические и лечебные меры для предотвращения распространения вирусных заболеваний.
Средства борьбы с вирусами:
Дезинфицирующие средства от вирусов
В настоящее время к дезинфектантам предъявляются повышенные требования.
Они должны обладать:
Например, препараты Септолит, которые производит компания Сателлит — это профессиональные дезинфектанты, отвечающие всем современным нормам и разрешенные Роспотребнадзором для дезинфекции как в различных учреждениях, так и в быту.
Рабочие растворы хлорсодержащих таблеток «Септолит ДХЦ» и жидкого концентрата «Септолит Плюс» идеально подходят для обеззараживания пола и других водостойких поверхностей при ежедневной и генеральной уборке любых помещений по противовирусному режиму.
Благодаря сочетанию дезинфицирующих и моющих свойств «Септолит Тетра» удается избавиться от бактерий, грибков и вирусов (в том числе, ВИЧ, гепатитов, полиомиелита, COVID-19) при обработке медицинских и маникюрных инструментов, оборудования, мебели, игрушек, посуды.
Три заблуждения, связанных с антивирусами: сигнатуры, вирусы и лечение
Поговорим о нескольких понятиях, которые зачастую понимаются ошибочно: какие бывают сигнатуры, что на самом деле такое вирусы и как работает лечение системы антивирусом.
Мы много и часто рассказываем о правилах поведения (а может, даже и выживания) в Интернете, да и в цифровом мире в целом. Очень надеемся, что делаем это все не зря, — что люди учатся и потом учат своих близких. Это правда очень важно.
Однако во всех этих рассказах встречается немало специфических терминов, которые кто-то может не знать или понимать неверно. Сегодня мы поговорим о трех самых распространенных заблуждениях, связанных с антивирусами, и попробуем объяснить, почему мы называем определенные вещи так, а не иначе.
Заблуждение первое: сигнатуры — это что-то устаревшее
Так исторически сложилось, что антивирусные базы в разговоре и даже статьях часто называют сигнатурами. В действительности же классические сигнатуры, пожалуй, ни один антивирус не использует уже лет 20.
Проблема возникла из-за того, что с самого начала — а это восьмидесятые годы — понятие «сигнатуры» не было определено четко. Например, отдельной статьи про них в «Википедии» нет даже сейчас, а в статье про вредоносные программы понятие «сигнатуры» используется без определения — как нечто всем известное.
Давайте же это определение дадим. Классическая вирусная сигнатура — это непрерывная последовательность байтов, характерная для той или иной вредоносной программы. То есть она содержится в этом вредоносном файле и не содержится в чистых файлах.
Например, характерная последовательность байтов может быть такой
Проблема в том, что сегодня с помощью таких классических сигнатур определить вредоносный файл достаточно проблематично — их создатели используют различные техники для того, чтобы запутать следы. Поэтому современные антивирусы используют значительно более продвинутые методы. И хотя в антивирусных базах примитивных записей по-прежнему много (больше половины), но есть еще и очень много умных записей.
Все это продолжают по старинке называть сигнатурами. И ладно бы просто называли — в общем-то, ничего страшного. Но это название зачастую используется уничижительно: мол, сигнатуры — устаревшие технологии. А на самом деле в этих «устаревших сигнатурах» порой какое-нибудь «разбиение пространства исполняемых файлов на кластеры в результате работы нейронной сети», которое никто и словами-то доступно не может описать.
В идеале стоило бы отказаться от использования самого термина «сигнатура» в смысле «любая запись в антивирусной базе». Но уж слишком прочно это слово вошло в обиход, да и альтернативного термина пока не придумали, так что все продолжают по привычке пользоваться им.
Поэтому важно иметь в виду, что само по себе слово «сигнатура» на самом деле не говорит ничего о продвинутости или примитивности.
Антивирусная запись — это запись, а стоящая за ней технология может быть как классической, простенькой, так и суперсовременной и навороченной, нацеленной на детектирование самых запутанных и высокотехнологичных вредоносных файлов или даже целых семейств вредоносов.
Заблуждение второе: вирусы — это любые вредоносные программы
Вы наверняка отмечали, что вирусные аналитики нашей компании избегают употребления слова «вирус», предпочитая ему странноватые слова вроде «вредонос» или «зловред», а между собой часто говорят «малвара». Делаем мы это вовсе не из суеверия или профессионального пафоса.
Дело в том, что «Virus» — это вполне конкретная разновидность вредоноса, отличающегося очень специфическим поведением: это зловред, который заражает собой другие, чистые файлы. Вирусные аналитики также используют для этого типа вредоносных программ термин «инфекторы».
Инфекторы в вирусной лаборатории пользуются особым статусом. Во-первых, их чуть сложнее распознать — с виду файл чистый, а на самом деле в нем инфекция. Во-вторых, они требуют особого подхода: почти всегда для них нужна специальная процедура лечения и, как правило, еще и особая процедура детектирования. Поэтому инфекторами занимаются люди, специализирующиеся именно на этом типе угроз.
Классификация вредоносных программ
И вот для того, чтобы не путать «вирус» в обывательском смысле с вполне определенной категорией зловредов, вирусные аналитики, в том числе и в разговоре с прессой, употребляют слова «вредонос» или «зловред», когда речь идет о вредоносных программах в целом.
И раз уж мы заговорили о правильных терминах, то вот еще несколько. «Червь» — это вредонос, способный к самостоятельному распространению за пределы одного устройства. А «малвара» (malware), если следовать точной классификации, не включает в себя «адвару» (adware) — грубое рекламное ПО — и «рисквару» (riskware) — легальное ПО, которое может нанести вред пользователю, если установлено не им, а злоумышленниками.
Заблуждение третье: антивирус не умеет лечить
Мне встречалось такое заблуждение, будто антивирус сканирует и детектирует, а если что-то найдет, то потом надо скачивать специальную лечащую утилиту и использовать уже ее. Отдельные утилиты для особо популярных зловредов у нас действительно есть — например, специализированные утилиты, позволяющие бесплатно расшифровать файлы, зашифрованные вымогателями. Но и антивирус справляется с лечением ничуть не хуже. А в подавляющем большинстве случаев — даже лучше, за счет драйверов в системе и других технологий, которые в утилиту не запихнешь.
Лечение заключается в следующем. В 1% случаев, когда пользователю антивируса «посчастливилось» натолкнуться именно на вирус — инфектор (причем, скорее всего, еще до установки антивируса, иначе бы зловред просто не запустился), антивирус действительно будет перебирать все зараженные файлы на компьютере и производить процедуру дезинфекции — восстанавливать оригинал. Кстати, то же самое антивирус будет делать, если потребуется расшифровать файлы, зашифрованные вымогателем-шифровальщиком — зловредом класса Trojan-Ransom.
А в остальных 99% случаев, когда зловред ничего не инфицирует, а просто делает (или собирается делать) свое черное дело, лечение действительно состоит в банальном удалении файла зловреда. Просто потому, что заражения других файлов нет, так что и лечить их не требуется. Уничтожаем файл — и система здорова.
В большинстве случаев лечение как таковое не требуется, достаточно просто удалить вредоносный файл
Но тут есть одно исключение — если зловред уже работает в системе (а не просто лежит на диске), то антивирус переходит в состояние «Лечение активного заражения», чтобы все сделать надежно и до конца, без рецидивов. Вот здесь можно прочитать полное описание данной врачебной процедуры.
Кстати, ситуация такая возникает обычно по двум причинам:
Заключение
На сегодня все. Надеюсь, теперь вы:
Как вирусы обманывают человека?
Метафорическая зарисовка. Представители различных генетических вариантов SARS-CoV-2 собрались за круглым столом и обсуждают план захвата мира. Рисунок в полном размере.
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Вирусы умеют не только размножаться внутри клеток хозяина, но и прятаться от его иммунитета. Способов избежать фатальных встреч с оборонными силами организма существует множество, но один из самых хитрых (и потому особенно интересных) механизмов демонстрируют вирусы с измененными генетическими последовательностями. Эта статья расскажет, что такое генотипы и генетические варианты вирусов и почему так важно о них знать.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Вирусы и микроорганизмы» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Зачем нам знать о генетических вариантах вирусов?
Новости о коронавирусе на протяжении всего 2020 года оставались самыми читаемыми, а количество научных публикаций о SARS-CoV-2 почти в пять раз превысило число статей по другой «громкой» теме — системам CRISPR/Cas: по данным PubMed их уже больше 60 тысяч! И здесь важнее следить не столько за драматической статистикой заражений и исходов, сколько за потенциалом и способностями возбудителя. Ведь вирусы умеют мутировать и порождать таким образом новые генетические варианты [1].
Генетические варианты вируса — это геномы какого-то вида (или штамма) вируса, отличающиеся друг от друга по последовательности нуклеотидов, и эти отличия могут обусловливать появление новых штаммов. «Генотип», «субтип», «генетический вариант» — термины, отражающие степень геномных различий (в порядке убывания).
По мере накопления знаний по этой теме опасения ученых лишь крепли: мутации могут влиять как на вирулентность, так и на тяжесть протекания заболевания, развитие лекарственной устойчивости и вероятность повторного заражения [2].
У SARS-CoV-2 весной 2020 года выделяли 3 генотипа: A, B и C [1]. Но сейчас особое внимание обращают на некоторые генетические варианты этого вируса и их географическое распределение (рис. 1) [3]. Известно, что даже самое маленькое изменение в генетическом материале возбудителя способно сильно сказаться на протекании либо распространении заболевания. На что же могли повлиять мутации в геноме SARS-CoV-2?
Рисунок 1а. Схематическое изображение эволюции SARS-CoV-2
Рисунок 1б. Карта распространения генетических вариантов SARS-CoV-2
Например, единственная мутация в гене поверхностного белка (spike-белка), вызвавшая замену его 614-й аминокислоты — D614G, — способствовала распространению SARS-CoV-2 по миру [4], [5].
Другая мутация, C14408T, в последовательности, кодирующей вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), потенциально способна влиять на развитие лекарственной устойчивости [6], [7]. Но самым поразительным можно считать случай, когда у пациента один генетический вариант SARS-CoV-2 заместился другим [8]. Дело в том, что наша иммунная система выстраивает защиту, по сути, от определенного вирусного генотипа. Если же вирус меняется, организм, встречавшийся с его предшествующим вариантом, новый может и не узнать.
Однако можно чуть-чуть успокоиться: мутации SARS-CoV-2 хоть и устроили хорошую суматоху, но так и не показали пока явной клинической значимости — в отличие от изменений ряда других вирусов. О них и пойдет речь дальше.
Вирусы гепатитов и компания
Гепатиты
В 2020 году Нобелевскую премию по физиологии или медицине вручили за открытие возбудителя одного из гепатитов — вируса гепатита С (ВГС, HCV) [9]. Болезнь может протекать без видимых симптомов, но при этом вирус сильно поражает печень. В крайних случаях развивается цирроз или даже рак печени [10]. К счастью, уже есть эффективные средства от гепатита С: по словам нобелевского лауреата Харви Олтера, противовирусные препараты прямого действия позволяют излечивать 95–98% пациентов [9]. Так в чем же подвох?
Интересно, что ВГС генотипов 1 и 4 обычно хуже поддаются терапии и требуют более продолжительного лечения, чем 2 и 3 [12].
| Генотипы ВГС | Субтипы |
|---|---|
| Генотип 1 | 1a, 1b |
| Генотип 2 | 2a, 2b, 2c, 2d |
| Генотип 3 | 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f |
| Генотип 4 | 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j |
| Генотип 5 | 5a |
| Генотип 6 | 6a |
| Генотип 7 |
При этом из-за высокой генетической вариативности, то есть больших различий между вирусными генотипами (до 30–35%), против ВГС не получается создать эффективную вакцину. Проблема усугубляется тем, что для тестирования прототипов вакцин нужны небольшие модельные животные, а получить мышей, способных одновременно болеть гепатитом С и имитировать человеческий иммунный ответ на инфекцию, очень трудно. И наконец, для изучения вируса in vitro нужно нарабатывать заразные частицы ВГС, а способные на это клеточные культуры появились лишь недавно [14].
Секвенирование вирусного генома показало, что в России циркулирует рекомбинантный вариант ВГС (RF2k/1b), генетически сходный с генотипами 1 и 2 одновременно. Из-за такой маскировки детекция этого генотипа затруднительна, а значит, и лечение бывает менее эффективным [15].
Итак, чтобы эффективно справиться с гепатитом С, нужно определить генотип его возбудителя. Не менее важно знать и генотип вируса, вызывающего другой гепатит — гепатит B. Да, от ВГВ (HBV) существует прививка [16]. Но! Есть основания считать, что генотипы ВГВ, несмотря на относительно небольшую вариативность (около 8% генома), по-разному влияют на тяжесть заболевания [17], [18].
Стоит, однако, учитывать, что результаты исследований связи вирусных генотипов с особенностями течения болезни весьма противоречивы. Чаще всего это связано с недостаточным размером изученных выборок, что, в свою очередь, обусловлено сложностями массового генотипирования. Из-за этого, например, на Тайване развитие гепатоцеллюлярной карциномы связывают с ВГВ генотипа В, а в Японии и КНР — с ВГВ генотипа С [19]. Тем не менее некоторые авторы приходят к выводу, что генотип ВГВ вообще не имеет большого клинического значения [20].
Хоть пока и нет общих рекомендаций проводить генотипирование ВГВ, ряд ученых призывает сделать его обязательным, поскольку пангенотипной терапии в случае гепатита В не разработано, а эффективность лекарств порой разнится в зависимости от генотипа.
Детекция генотипа вируса может стать хорошим подспорьем для врачей как минимум в двух направлениях: в определении вероятности развития той или иной формы болезни у конкретного пациента и в персонализации лечения. Однако подобных исследований крайне мало, можно даже сказать, что это поле еще совсем не пахано.
Денге
Мы уже заметили, что при разработке вакцин необходимо знать и учитывать разнообразие генотипов вируса. В этом отношении яркими примерами могут служить подходы к производству вакцин от гриппа и менее распространенной болезни — лихорадки денге, о возбудителе которой мы сейчас и расскажем [21].
Рисунок 2. Географическое распределение эндемичных по вирусу денге районов в 2011 году
У вируса денге выделяют четыре серотипа, то есть четыре группы вирусов с общей антигенной структурой. Генотипов у этого возбудителя больше, соответственно, и отслеживать их сложнее. Увы, но знания серотипа порой недостаточно для качественной вакцинации. Например, низкую эффективность одной из проходивших клинические исследования вакцин против серотипа 2 можно объяснить большой вариативностью составляющих его генотипов [22].
Существует мнение, что если эффективность вакцин против денге в новых клинических исследованиях останется низкой, при создании вакцинных препаратов необходимо будет отталкиваться именно от результатов генотипирования [21]. Это нужно и для исключения возможного антителозависимого усиления инфекции в случае, если вакцина будет защищать не от всех серотипов/генотипов, с которыми может встретиться отдельный организм.
Примечание
Антителозависимое усиление инфекции (ADE, antibody-dependent enhancement) — феномен, при котором связывание вируса с cубоптимальными нейтрализующими или не нейтрализующими антителами способствует его проникновению в иммунные клетки с последующей репликацией в них. Из-за ADE непроверенные вакцины могут быть очень опасными: при встрече с инфекцией вместо обеспечения защиты некоторые из них способны утяжелять течение заболевания [23].
Подводя итог, можно сказать, что знание генотипов вирусов необходимо для отслеживания распространения заболеваний по миру, для их лечения, а также для получения эффективных вакцин. К сожалению, пока генотип-специфичная борьба с инфекциями сильно ограничивается в том числе и недостатком информации о вирусных штаммах.
Но как вообще появляется это штаммовое разнообразие?
Вирусная хитрость: механизмы изменения геномов
Вирусы способны изменять свои свойства внутри клеток хозяев и в результате становиться заразнее и опаснее. Впрочем, не стоит пугаться. Обычно вирусная эволюция протекает в сторону снижения летальности, поскольку вирусу, который не убивает своего носителя и почти не вызывает симптомов, намного проще распространиться в популяции. Хоть геномы вирусов и изменяются с довольно высокой частотой, на деле мутации чаще оказываются нейтральными, не влекущими заметных последствий для вируса и его хозяина. Очень немногие из них действительно вносят вклад в дальнейшую эволюцию [24].
В основе способности вирусов к изменениям лежат мутации и/или обмен генетическим материалом между разными вирусами, результаты которых закрепляются или не закрепляются давлением естественного отбора.
Мутация — это изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома, нередко приводящее к изменениям структуры и/или функций организма или вируса. Мутации могут возникать из-за ошибок работы ферментов, создающих копии геномов, или под действием среды.
Когда одну и ту же клетку заражает два родственных вируса, могут образовываться гибридные вирусы, содержащие измененный по сравнению с родительскими формами генетический материал. Этот процесс называют рекомбинацией или реассортацией, если у вирусов сегментированный геном (в частицу он упаковывается отдельными сегментами типа мини-хромосом) [25].
Для справки
До введения термина «реассортация» в научный обиход рекомбинацией называли любой обмен генами, включая и те процессы, которые сейчас со знанием дела именуют реассортацией [25].
Реассортация очень напоминает появление детей у родителей: когда два разных вириона попадают в одну клетку и приступают к размножению, они могут обменяться частями геномов (рис. 3). В результате получится новая вариация (штамм) вируса, которая может значительно отличаться от своих предков [25]. Такие вирусы порой становятся неузнаваемыми для иммунной системы и распространяются, вызывая эпидемии и пандемии. Этот сценарий характерен, например, для вирусов гриппа. Некоторые исследователи винят в пандемии той же «испанки» именно вирусную реассортацию [26].
Рисунок 3. Реассортация вирусов, которая приводит к появлению штамма с измененным генетическим материалом
Благодаря мутациям и обмену генетическим материалом вирус может даже менять своего хозяина. Так SARS-CoV-1 от летучих мышей перешел в семейство виверровых (к мусангам и циветам), а затем и к людям. В начале 2000-х этот вирус вызвал эпидемию, охватившую 29 стран [28].
Новые генотипы могут возникать и в ходе лабораторных пассажей, когда вирусом последовательно заражают нескольких животных, выделяя из них новую чистую культуру возбудителя [29]. Такая процедура нужна, в частности, для тестирования противовирусных лекарств и вакцин.
Свойства вируса во время пассажей меняются ступенчато. В первых пассажах в основном обнаруживают вирионы, изменившие какой-то один генетический признак. Но с увеличением числа пассажей у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.
Кроме рекомбинации и мутаций, изменчивость вируса может быть обусловлена влиянием хозяина (host-controlled variation). Такие модификации не затрагивают генетический материал вируса и встречаются, например, у ДНК-содержащих бактериофагов, вирусов гриппа и Сендай. Клетка может влиять на характер синтезируемых в ней вирусных компонентов. Или в вирусную частицу могут попадать хозяйские белки и липиды. Поэтому при смене клетки-хозяина в структуре оболочки вириона меняются и антигены, с помощью которых организм узнает вирус.
Итак, образование новых вирусных генотипов — совершенно обычное явление, основанное на стандартных эволюционных процессах. Однако как нам эти генотипы детектировать?
Как выявляют генотипы вирусов?
Теперь, когда мы знаем, как возникают вирусные генотипы и как от генетического варианта возбудителя могут зависеть течение, распространение и лечение заболевания, перейдем к обсуждению лабораторных методов. Они позволяют нам определять, вирус какого генотипа вызвал болезнь у конкретного пациента. Рассмотрим методы детекции генотипов на примере вируса ВГС. В настоящее время лабораторные анализы, используемые в схемах диагностики и лечения гепатита C, представлены серологическими тестами для обнаружения антител к ВГС, молекулярными тестами для выявления и количественной оценки РНК ВГС, а также методами генотипирования возбудителя [30].
При первоначальной диагностике гепатита C учитывают симптоматику и уровни ферментов печени (особенно аланинаминотрансферазы, АЛТ) в крови. У пациентов с подозрением на гепатит C иммуноферментным анализом (EIA) [31] или хемилюминесцентным иммуноанализом (CIA) выявляют антитела к ВГС. В популяциях с низким риском инфицирования этим вирусом отрицательного результата EIA или CIA достаточно, чтобы исключить заражение гепатитом C. Но важно помнить, что у пациентов с ВИЧ или последней стадией почечной недостаточности серологические тесты на антитела к ВГС могут давать ложноотрицательные результаты. Если тест выявил антитела или допускается возможность ложноотрицательного результата, в организме пациента должны искать РНК самогό вируса.
Определение статуса инфекции ВГС, решение о лечении и мониторинг ответа на него зависят от трех важных факторов: обнаружения РНК вируса гепатита С, ее количества и вирусного генотипа. Для оценки всех этих параметров есть несколько коммерческих тест-систем. Они различаются по диапазону обнаружения, чувствительности, специфичности, стоимости и сложности использования.
Выявление РНК вируса гепатита С основано на принципе амплификации нуклеиновых кислот [32], причем применяют здесь комбинацию разновидностей полимеразной цепной реакции (ПЦР): качественную ПЦР, опосредованную транскрипцией амплификацию (ТМА) и количественную ПЦР в реальном времени.
Генотипирование ВГС необходимо для назначения оптимальной схемы лечения. Генотип этого вируса можно определить несколькими методами, нацеленными на гены вирусных белков (E1, NS4 и NS5) и на 5′-нетранслируемую область (5′-UTR) генома ВГС. Они включают простую ПЦР, гибридизацию с генотип-специфичными зондами и ПЦР в реальном времени. Однако для более точного определения вирусного генотипа следует прибегать к методам секвенирования нового поколения (NGS) [33].
Наш проект HaploSense
Как мы уже поняли, определять генотипы сложно, поскольку практически нет быстрых и доступных тестов. Наша команда студентов и аспирантов под названием Moscow 2020 решила изменить эту ситуацию.
На международном конкурсе iGEM в этом году мы представили проект детектора генотипов вируса гепатита С. В основе детекции лежит система CRISPR-Cas, с которой многие читатели уже знакомы [34], [35], а принцип работы напоминает популярные методы детекции SHERLOCK (Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) и DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) [35]. Но есть и важные отличия, о которых сейчас расскажем.
В своей тест-системе мы использовали самый маленький из открытых к этому моменту Cas-белков — CasX (или Cas12e) из Deltaproteobacteria: он состоит из 980 аминокислотных остатков по сравнению с 1300 у Cas9 [36]. Как и Cas13a с Cas12a, маленький CasX обладает коллатеральной нуклеазной активностью (может неспецифически резать нуклеотидные последовательности, с которыми встретится после связывания с мишенью): она позволяет разрезать олигонуклеотиды с флуоресцентными метками после прикрепления белка к геному вируса. Но ВГС — РНК-содержащий вирус, поэтому для связывания с ним CasX нужно провести дополнительную реакцию: с помощью обратной транскрипции получить комплементарную последовательность ДНК.
Итак, в нашей системе четыре основные стадии (рис. 4):
Пока наша тест-система предполагает определение только одного генетического варианта ВГС — рекомбинантного RF2k/1b, распространенного в России. В 2020 году доступ в лабораторию для нас был закрыт, поэтому систему предстоит еще собрать и протестировать. Если все лабораторные испытания пройдут успешно, мы планируем расширить специфичность системы на все генотипы вируса, не умножая при этом количество приборов.
Рисунок 4. Схема детекции генотипов ВГС с помощью HaploSense
Такая на первый взгляд сложная система позволит определять генотип возбудителя гепатита С быстрее, вне специально оборудованной лаборатории и с не меньшей точностью, чем ПЦР. Мы надеемся, что когда-нибудь такой подход поможет сделать тестирование массовым и доступным.
Подробнее о iGEM
В 2020 году команда студентов с биологического факультета МГУ представила свою разработку на самом престижном международном конкурсе по синтетической биологии — The International Genetically Engineered Machines competition (iGEM). С английского название переводится как «Международное соревнование генно-инженерных машин». Это соревнование учредили в 2003 году в Массачусетском технологическом институте (Бостон, США). Школьники, студенты и аспиранты со всего мира и с разным академическим бэкграундом, начиная от журналистов и экономистов и заканчивая айтишниками и биологами, собираются в команды, в течение года работают над актуальной задачей и представляют свои проекты на осенней, финальной конференции Giant Jamboree. Конкурс iGEM уникален тем, что формирует открытое сообщество людей, которые обмениваются друг с другом и миром своими наработками. Выгодно отличают конкурс также комплексность и разноплановость проектов: упор делается на применение инженерных принципов и подходов, использование методов моделирования, обсуждение и проработку проекта с потенциальными пользователями и экспертами из разных областей (науки, бизнеса, права, государственного управления и т.д.). Образовательная деятельность, популяризация наук, налаживание между учеными и обществом мостов с целью обсуждения актуальных проблем — все это тоже входит в задачи команды. В этом году из-за пандемии конкурс проходил онлайн. Ядро нашей команды составляли студенты биологического факультета МГУ, которые получили бесценный опыт и выиграли золотую медаль. Однако подробнее об iGEM мы поговорим с вами в следующий раз [39].
Работа в команде
В конце марта 2020 года команда Moscow 2019 собрала новый состав для участия в конкурсе iGEM (рис. 5). Тогда впервые встретились незнакомые друг другу люди с общим желанием — создать проект в области синтетической биологии, который мог бы что-то изменить в мире.
Идея нашего проекта появилась только спустя полтора месяца, в начале мая. iGEM предлагает полную тематическую свободу: можно делать хлеб из дрожжей на Марсе, очищать воду бактериями, синтезировать натуральную краску для волос или разрабатывать системы мониторинга заболеваний. На выбор темы для нашего проекта сильно повлиял руководитель команды, Алексей Константинович Шайтан. Его лаборатория использует в работе системы CRISPR-Cas, а на их основе можно создавать детекторы заболеваний. Пандемия COVID-19 только начиналась, но уже было ясно, что SARS-CoV-2 необходимо выявлять быстро, массово и с высокой точностью. Так мы и создали наш проект — с целью детектировать генотипы коронавируса.
Очень важное требование конкурса — актуальность разработки. Другими словами, важно было понять, что наш проект нужен людям и его будут использовать. Этим проекты iGEM сильно отличаются от рутинной работы научных лабораторий. Именно поэтому мы встречались с экспертами, писали письма главному эпидемиологу Министерства здравоохранения, Николаю Ивановичу Брико, размещали посты в социальных сетях. Обратная связь полностью изменила наш проект: HaploSense переориентировался на детекцию генотипов вируса гепатита С.
С другой стороны, важен был сам детектор — как он будет работать, выглядеть, сможем ли мы его вообще собрать. Здесь нам на помощь пришел спонсор, компания BIOCAD. Эксперты компании консультировали нас относительно идеи проекта и ее реализуемости в столь короткие сроки. Они рассказали нам, как готовить патенты и выводить продукт на рынок. А это далеко не простые процессы.
В результате мы проанализировали гору тематической литературы, смогли придумать целостную систему на основе технологий CRISPR-Cas, провели ее моделирование и биоинформатический анализ.
Надо сказать, что организаторы iGEM помогают командам на протяжении всего пути: устраивают семинары, знакомят со специалистами, создают удобные платформы. А особенно поддерживают взаимодействие между командами. Все полгода мы общались и встречались с мотивированными ребятами из Америки, Эстонии, Индии, Франции, Германии и России (в этом году в конкурсе участвовали две команды из нашей страны). После таких встреч мы понимали, что можем сделать хороший, качественный проект, даже будучи студентами.
Рисунок 5. Команда iGEM Moscow 2020
Пандемия, конечно, сыграла свою роль в работе нашей команды: мы работали дистанционно и встречались друг с другом офлайн всего четыре раза. По-настоящему сплоченными мы стали, когда приблизились конкурсные дедлайны. Мы уложились в срок благодаря слаженной работе команды. Одному человеку было бы невозможно справиться: кроме разработки идеи проекта, моделирования и проведения экспериментов нам предстояло сделать сайт с описанием проекта, два видео о команде и работе, заполнить форму безопасности, написать обзор по теме, да и это еще не все. Именно поэтому проект iGEM — прежде всего командная работа.
Итоги конкурса подводятся осенью, в начале ноября, на Giant Jamboree — огромной конференции, где команды, профессора, лекторы и судьи собираются, чтобы обсудить проекты, подметить их сильные и слабые стороны, сформировать новые коллаборации и просто хорошо провести время. Это финал iGEM: проекты уже подготовлены, критерии конкурса соблюдены. Казалось бы, можно выдохнуть… Но здесь же команды встречаются с судьями — исследователями, которые будут оценивать проекты и детально их рецензировать. Мы, конечно, тоже общались с судьями (в этом году онлайн): в воскресенье, в 17:00, нас спрашивали, почему мы использовали LAMP, сколько тест-полосок будем применять, ну и много чего другого. А после нашу команду ждала неделя, полная лекций по синтетической биологии и общения с коллегами со всего мира, а также викторины по синтетической биологии и церемония награждения. В итоге мы выиграли золотую медаль и создали хороший проект, который продолжим развивать и, надеемся, доведем до состояния полноценной тест-системы, подходящей для обычных поликлиник.
Мы советуем всем молодым исследователям принимать участие в iGEM. Этот конкурс стал для нас лучшим событием 2020 года. Создать проект с нуля возможно, нужно только желание!