молекулярные часы что это
Молекулярные часы что это
Молекулярные часы: в гомологичных белках разных организмов количество различий в аминокислотах пропорционально времени их расхождения от общего предка. Зная количество различий по аминокислотам, можно вычислить время возникновения таксона. Этот же принцип справедлив и для различий по генам нуклеиновых кислот.
 |
| Рис. 2. Аддитивное дерево, построенное по различиям в транспортных РНК. Из Омельянчук, Колчанов, 1987. |
— локальное нарушение теории молекулярных часов: количество замен в митохондрии много больше (309), чем в сестринской ветви (в ветвлении “общий с митохондрией предок”- эубактерии замен 125+131=256 и “общий с митохондрией предок”- хлоропласты 121+131=252). Известно, что практически все гены в митохондриях мутируют значительно чаще, чем ядерные гены и гены прокариот. Известно также, что молекулярная эволюция у симбионтов и паразитов зачастую идет гораздо быстрее, чем у свободноживущих организмов.
Как определялось время расхождения таксонов? Зная время расхождения однодольных и двудольных растений (125 млн. лет) и время расхождения хордовых и ближайших к ним беспозвоночных (около 680 млн. лет) и количество различий в тРНК между членами этих пар, рассчитывалась скорость замен в тРНК хлоропластов и тРНК эукариот. Предполагая близкую скорость молекулярной эволюции у их предков, авторы рассматриваемой работы определяют время для каждой точки ветвления.
Кимура провел тщательный математический анализ закрепления нейтральных мутаций и доказал, что на скорость изменения нейтральных признаков не влияет ни размер популяций, ни частота смены поколений и что она выражается удивительно простой формулой:
Таблица 1. Приблизительные характеристики рРНК прокариот и эукариот.
Молекулярные часы работают не так, как мы думали
Молекулярные часы работают не так, как мы думали
Автор
Редактор
Ранее считалось, что молекулярные таймеры живых организмов работают по такой схеме: активируется ген часов, в результате его работы образуется белок-регулятор, который подавляет работу гена. Ген остается неактивным, пока не деградирует белок-регулятор. Благодаря такой петле обратной связи активность гена часов, а также концентрация белка-регулятора меняются циклически, что дает организму нечто вроде метронома — «внутренних часов». Однако в недавно опубликованной в журнале Science работе было показано, что деградация белка-регулятора не является необходимой для того, чтобы поддерживать циклическую активность гена часов. По мнению исследователей, ключевую роль играют модификации этого белка, которые «отключают» его и без физического разрушения молекулы.
Каждые сутки наша планета совершает оборот вокруг своей оси, благодаря чему условия жизни каждого существа на Земле регулярно меняются. Чтобы приспособиться к таким изменениям и быть готовыми к каждому наступлению темноты или похолоданию, организмы ориентируются на внутренние часы. В соответствии с ходом таких часов регулируются процессы обмена [1], а также циклы сна/бодрствования*.
Физически «внутренние часы» представляют собой систему генов, которые активируются и дезактивируются по системе отрицательной обратной связи. В простейшем случае ген часов активируется, в результате чего синтезируется белок, который подавляет работу гена. Ген снова начинает работать только после того, как деградирует этот белок. В результате активность генов часов, а также концентрации белков, участвующих в регуляции работы этих генов, изменяются регулярным образом. А уже имея такой «метроном», организм может отсчитывать промежутки времени, соответствующие циклам смены условий внешней среды.
Рисунок 1. Новая модель регуляции циркадных часов [5]. Деградация белка-регулятора (осуществляемая протеасомой, изображенной слева) не важна для поддержания циклов активации-дезактивации генов часов. Главную роль в «отключении» белка-регулятора играют его модификации (фосфорилирование обозначено буквой Р), набрав определенное количество которых, белок перестает работать. Уничтожится ли он после этого или нет — не так важно.
Однако американские ученые обнаружили, что привычная схема устройства часов нуждается в пересмотре [5]. Объектом их исследования стал гриб Neurospora crassa. Белок-регулятор часов у этого гриба называется FREQUENCY (или FRQ). Было известно, что у мутантов, у которых время жизни этого белка увеличено, длина периода цикла также увеличена. Кроме того, если «сломать» систему уничтожения этого белка, в результате чего он будет накапливаться в клетках, суточные циклы у гриба пропадают. Странно, но в последнем случае, несмотря на то, что суточные циклы у гриба очевидным образом не проявлялись, активность гена frq все-таки продолжала циклически изменяться. Получается, что деградация белка FRQ не была необходима для поддержания циклической активности гена (хотя, видимо, была нужна для того, чтобы организм изменял свою активность в соответствии с ходом часов).
Ученые выдвинули предположение, что на самом деле для поддержания циклической активности генов часов нужна не деградация белка-регулятора, а просто его «выведение из строя», которое происходит под действием модификаций. Белок FRQ фосфорилируется по более чем сотне сайтов, и когда он приобретает определенное количество этих модификаций, они изменяют его структуру. В результате такого изменения структуры белок теряет способность репрессировать работу гена часов, который снова начинает активно работать. Эксперименты со штаммами грибка, у которых не было фермента, ответственного за деградацию FRQ, подтвердили: после того, как белок-регулятор получил достаточное количество модификаций, уже не важно, будет ли он уничтожен или продолжит находиться в клетке — его деградация не требуется, чтобы ген часов продолжал циклически работать. А вот если заблокировать работу ферментов, которые фосфорилируют белок-регулятор, циклические изменения активности гена часов пропадут.
Таким образом, схема работы молекулярных часов на данный момент представляется такой: ген часов работает, в результате чего синтезируется белок, отключающий ген. Белок плавает в цитоплазме, накапливая модификации (фосфорилирование). Модификации, по-видимому, отличаются функционально — более ранние модификации нужны, чтобы сделать возможными более поздние. Когда молекула белка-регулятора соберет необходимый набор модификаций, она перестанет репрессировать ген часов, который снова включится в работу (рис. 1). То есть белку-регулятору совсем не нужно деградировать, чтобы «позволить» гену активироваться.
Предложив новую модель, ученые нашли и в других опубликованных ранее работах подтверждения своих выводов. К примеру, у мутантов мушек Drosophila, у которых белок-регулятор медленно деградировал, даже получив множественные модификации, суточные циклы все равно продолжались, хотя и были замедленными [6]*. Активность гена часов у них возобновлялась даже в присутствии неактивных «старых» молекул белка-регулятора — то есть, опять же, его деградация была не нужна, чтобы циклы продолжались. Кроме того, известно еще несколько примеров, когда блокирование путей уничтожения белка-регулятора лишь незначительно влияло на ход молекулярных часов [7–9]. Таким образом, есть основания думать, что новая модель устройства молекулярных часов будет применима к самым разным организмам**.
* — Сон, в том числе у мушек, управляется не только циркадным, но и гомеостатическим механизмом, отвечающим за желание поспать: «Бессонные ночи дрозофилы» [10] — Ред.
** — О рассинхронизации «внутренних часов» в разных тканях, при патологических процессах и старении даже у одного организма можно прочитать в статьях «Эпигенетические часы: сколько лет вашему метилому?» [11] и «Молекулярные часы нашего сердца» [12] — Ред.
Молекулярные часы
Чем больше времени отделяет два вида от той эпохи, когда жил их общий предок, тем больше различаются ДНК этих видов.
Согласно центральной догме молекулярной биологии, химическая индивидуальность каждого живого организма определяется последовательностью пар оснований в ДНК этого организма. Теория эволюции утверждает, что виды развиваются в течение времени, и параллельно этому развитию изменяются их ДНК. К изменению ДНК могут привести различные события. Например, медленное накапливание мутаций, массовые ошибки при копировании или проникновение последовательности вирусных нуклеиновых кислот. Но одно можно утверждать смело — чем больше прошло времени с тех пор, как жил общий предок двух видов, тем длиннее период, в течение которого происходили эти изменения, и, следовательно, тем сильнее отличаются последовательности ДНК этих двух видов.
Следует отметить несколько моментов, касающихся этого утверждения. Во-первых, подсчитав различия между последовательностями ДНК, мы можем построить генеалогическое древо всех живых организмов. Например, у человека и шимпанзе совпадают 98% ДНК. Это означает, что наш общий предок жил совсем недавно. В то же время у человека и лягушек совпадающая часть ДНК значительно меньше, следовательно наша ветвь отделилась от ветви, занимаемой земноводными, значительно раньше. Теория эволюции предсказывает, что построенное таким образом генеалогическое древо должно быть сходно с древом, построенным в прошлом веке на основании изучения окаменелостей. По моему мнению, совпадение двух генеалогических древ является одним из самых убедительных доказательств эволюции. Оно также показывает, что теория эволюции может быть подвергнута проверке (как уже говорилось во Введении, это одно из важнейших требований любой научной теории), поскольку могло оказаться, что люди генетически более близки к лягушкам, чем к шимпанзе.
Метод молекулярных часов использует данные ДНК более фундаментально. Если изменения ДНК происходят с некоторой средней скоростью — если молекулярные часы тикают равномерно — то, подсчитывая количество различающихся пар оснований в последовательностях двух видов, мы можем получить представление о времени жизни их последнего общего предка. Если частота изменений ДНК постоянна, анализ современной ДНК может рассказать нам о шкалах времени на разных этапах развития генеалогического древа.
В 1980-е годы, когда впервые была предложена концепция молекулярных часов, от исследователей ожидали услышать, что изменения во всех ДНК происходят с одинаковой скоростью — что все часы тикают с одним и тем же интервалом. Однако оказалось, что существует много разных молекулярных часов, и все они идут с разной скоростью. Например, пары оснований в последовательности важного гена не могут сильно измениться без ущерба для организма в целом, поэтому часы, показывающие время для пар оснований в таких генах, идут относительно медленно. С другой стороны, большинство сегментов ДНК не влияют на химические процессы в организме, поэтому для этих сегментов часы могут идти быстрее.
Пожалуй, больше всего привлекает в методе молекулярных часов перспектива его применения к недавней эволюции человека. Чтобы лучше все это понять, вам нужно знать, что внутри каждой клетки высокоразвитых организмов имеются крохотные органеллы — митохондрии. В них сгорает топливо клетки — то есть осуществляется важнейшая функция обмена веществ. Считается, что митохондрии впервые проникли в более сложно организованные клетки миллионы лет назад в процессе симбиоза. Две клетки, эволюционировавшие независимо друг от друга, обнаружили, что им пойдут на пользу партнерские отношения, при которых одна клетка будет жить внутри другой. Тот факт, что в митохондрии содержится собственная небольшая петлевидная ДНК (в митохондриальной ДНК человека 26 генов), говорит о том, что это событие произошло очень давно.
В сперматозоидах нет митохондрий, поэтому вся митохондриальная ДНК в вашем организме получена вами из яйцеклетки матери. Другими словами, митохондриальная ДНК передается по материнской линии. Установлено, что молекулярные часы митохондриальной ДНК тикают почти в 10 раз быстрее, чем часы ДНК, содержащейся в клеточном ядре. Поэтому для анализа и была выбрана митохондриальная ДНК — ведь за определенный промежуток времени в ней произойдет значительно больше изменений, чем в ядерной ДНК.
Митохондриальная ДНК впервые привлекла к себе всеобщее внимание после того, как в 1987 году группа американских исследователей получила митохондриальные ДНК от 147 представителей различных рас из разных уголков мира и установила количество мутаций, их различающих. По результатам первого анализа складывалось впечатление, что все современные люди ведут свою родословную от одной и той же женщины, которая жила в Африке около 200 000 лет назад. Эту женщину немедленно нарекли Евой (или, для большей наукообразности, Митохондриальной Евой) и даже поместили ее на обложку крупного общественно-политического журнала.
К сожалению, этот сногсшибательный результат не выдержал испытания более полным анализом, и ученые больше не вспоминают Еву (она пала жертвой критического анализа ДНК, сделанного компьютерной программой). Согласно последним научным веяниям, данные ДНК указывают на то, что все современные люди произошли от довольно небольшой популяции — около 5–10 тысяч человек, — жившей в Африке 100–200 тысяч лет назад.
Сверим часы
Молекулярные часы — это пока не самый точный прибор, однако со временем он будет неплохо откалиброван
эта и другие иллюстрации к обзору выполнены компанией Visual Science
Автор
Редакторы
Как научиться определять время, сравнивая молекулы? В настоящее время развитие молекулярной биологии, биоинформатики и геномики позволяет находить новые подходы к изучению центрального вопроса всей биологической науки — проблемы эволюции живых систем. Одним из весомых вкладов этих относительно молодых дисциплин в развитие данной области является метод оценки времени эволюционного расхождения таксонов — так называемый метод «молекулярных часов».
Развитие молекулярной систематики
Идея использовать биомолекулы для определения степени родства между видами, как и многие другие важные идеи в биохимии прошлого века, пришла в голову Лайнусу Полингу (Linus Pauling [1]). Предложенная им и его коллегой Эмилем Цукеркандлем (Emil Zuckerkandl) в 1965 году концепция была достаточно проста и основывалась примерно на тех же принципах, на которых основана систематика морфологическая. Ученые рассудили, что чем больше сходство между биомолекулами, синтезируемыми организмами, тем более филогенетически близки сами организмы, и наоборот. В первых экспериментах, посвященных изучению данного вопроса, Полинг и его коллеги исследовали некоторые биохимические характеристики (такие, например, как молекулярная масса и электрофоретическая подвижность) гемоглобина, выделенного из крови представителей разных таксонов. В результате оказалось, что гемоглобины человека и гориллы отличаются заметно меньше, чем они вместе отличаются от гемоглобинов лошади. Еще дальше от этой группы стояли гемоглобины курицы, ну а самые сильные отличия наблюдались в белках, выделенных из крови рыбы [2]. Несложно заметить, что выводы зарождающейся молекулярной систематики в этом случае полностью совпали с устоявшимися представлениями морфологов. Разумеется, подобный результат вполне удовлетворил исследователей.
Собственно, время расхождения таксонов при таком подходе определяется исходя из двух параметров: примерной скорости накопления изменений в неких биомолекулах и непосредственного количества этих изменений (различий между биомолекулами таксонов, время расхождения которых пытается определить исследователь). Чем раньше виды разошлись, тем больше отличий в последовательностях биополимеров они накопили. Зная количество различий и скорость их появления можно рассчитать время, за которое они образовались. Однако это только теория, а на практике оба этих показателя довольно трудно поддаются точной оценке.
Рисунок 1. Филогенетическое дерево трёх гипотетических видов A, B и C. Эти виды имеют общего предка X. Виды B и C имеют более позднего предка Y.
Одна из первых попыток осуществить калибровку молекулярных часов была предпринята в конце 60-х годов работах Винсента Сэрича (Vincent Sarich) и Алана Уилсона (Alan Wilson), изучавших реципрокное сродство иммуноглобулинов разных родов и видов приматов [3]. Как и Полинг, эти исследователи работали с белками. Сначала выделялись белки из трех разных таксонов. Для простоты назовем их A, B и C (рис. 1). Причем известно, что B и C эволюционно ближе друг к другу, чем к A. К каждому белку были получены антитела, после чего проверялось сродство этих антител к «чужим» белкам. Сначала антитела к белку А тестировались на сродство к белкам В и С, после чего антитела к белкам В и С тестировались на сродство к более эволюционно удаленному белку А. Их целью было выяснить правильность гипотезы о том, что скорость накопления изменений в белковых молекулах является постоянной для изучаемых видов. Данные исследования эту гипотезу не опровергли, поскольку показали, что скорость накопления изменений в линии “В” оказалась такой же, как и скорость накопления изменений в линии “С” с момента их расхождения. После этого ученые предположили, что, зная время расхождения линий “В” и “С” из палеонтологических данных, можно откалибровать получившиеся молекулярные часы и впоследствии датировать время расхождения таксонов, изучая только их биомолекулы. Впрочем, очень быстро выяснилось, что это не так просто, поскольку их попытки осуществить подобные операции не увенчались успехом — молекулярные оценки сильно расходились с данными палеонтологии.
Несколько отличный подход к определению степени родства видов молекулярными методами применили Бриттен и Кон в 1968 году [7]. Суть их метода заключалась в сравнении сразу всей ДНК исследуемых видов. Это делалось таким образом: сначала молекулы геномной ДНК подвергались денатурации, после чего одноцепочечные молекулы отжигались друг с другом. Далее исследовался полученный гетеродуплекс. Логика была такова: чем больше энергии придется затратить для того, чтобы осуществить денатурацию полученного дуплекса (чем дуплекс более прочен), тем ближе виды между собой, поскольку очевидно, что стабильность такой гибридной ДНК напрямую зависит от того, насколько похожи две частично комплементарные цепи.
Результаты этих исследований не были очень впечатляющими, поскольку тогда еще не было четкого понимания того, что геном состоит далеко не только из уникальной ДНК. Картину портили всевозможные геномные повторы, количество и размер которых, как оказалось, плохо коррелирует со степенью различия между видами (кстати, данная работа сделала серьезный вклад в их изучение) [8]. Возникновение и исчезновение повторов — это непредсказуемый процесс, который может быть вызван огромным числом самых разных причин. К тому же, предполагать, что число повторов изменяется с постоянной скоростью у всех видов в любой исторический момент, довольно наивно.
К 70-м годам прошлого века стало ясно, что если имевшиеся тогда методы молекулярной систематики и подходят для того, чтобы классифицировать эволюционно далекие объекты, то когда речь заходит о близких видах, сопоставление белков и полных геномов обнаруживает явные неточности и дает ненадежные результаты. Например, оказалось, что биохимические различия между шимпанзе и человеком настолько малы, что, судя только по ним, невозможно будет отделить один вид от другого. Становилось понятно, что для более точных результатов надо искать и сравнивать конкретные последовательности ДНК
ДНК: какие куски лучше сравнивать?
Как уже говорилось, одним из самых тонких мест в методике молекулярных часов является определение скорости накопления изменений, которую довольно проблематично точно оценить. К тому же, в большинстве случаев эта скорость для удобства считается постоянной на всем времени с момента расхождения изучаемых видов, а говорить об этом не всегда правомерно. Классическим эволюционистам идея постоянства скорости накопления мутаций была непонятна совершенно. Ведь согласно общепризнанной в то время синтетической теории эволюции, скорость эволюционного изменения видов определяется факторами среды и интенсивностью естественного отбора, а, следовательно, она просто обязана колебаться, поскольку условия среды меняются с переменной скоростью.
Первые идеи по разрешению сложившегося противоречия были предложены японским биологом Моту Кимура (Motoo Kimura), который сформулировал так называемую «нейтральную теорию» молекулярной эволюции [9]. Предположение заключалось в том, что большинство изменений в последовательности геномной ДНК никак не отражается на фенотипе особей, а, следовательно, не попадает под действие естественного отбора. Интересно, что по этой причине, концепцию Кимуры некоторое время считали противоречащей классическому дарвинизму. Однако сейчас очевидно, что никакого противоречия нет.
Дело в том, что отбор преимущественно действует на уровне строения белковых молекул. Ведь для того, чтобы организм нормально существовал, его белки должны правильно работать, а это невозможно в случае, если белковые молекулы накопят слишком много структурных изменений. Следовательно, организмы, синтезирующие дефектные белки, погибают, а выживают только те, чьи белковые молекулы нормально функционируют и не содержат критического количества перестроек. Но, как оказывается, отсутствие различий в белковых молекулах видов вовсе не говорит о том, что этих различий нет в последовательностях ДНК.
Генетический аппарат клетки устроен таким образом, что непосредственно на структуру белков (а, следовательно, на фенотипические проявления признаков, подвергающиеся действию отбора) влияют далеко не все последовательности ДНК. Сейчас хорошо известно, что в среднем у эукариотических организмов количество структурных генов может колебаться от 10% до 40% от всего генома. Остальные последовательности представлены межгенными спейсерами, регуляторными участками, мобильными элементами и гетерохроматиновыми повторами, мутации в которых далеко не всегда отражаются на фенотипе особи и в массе своей оказываются именно нейтральными.
Разумеется, эти представления появились не сразу. В 30-е годы XX века считалось, что в хромосомах нет ничего, кроме генов, линейно соединенных между собой наподобие бусин на нити. Эти соображения были особенно популярны в период активного изучения политенных хромосом дрозофилы, которым присуща характерная поперечная исчерченность. Поперечные полоски на таких хромосомах, как раз и считали некоторое время генами, наблюдаемыми непосредственно в световой микроскоп. К 60-м годам становится ясно, что между генами содержится множество нуклеотидных последовательностей, которые тогда считались «мусорными», ну а к середине 70-х годов стало ясно, что и сама тонкая структура гена такова, что не все его участки непосредственно влияют на фенотипическое проявление признака (рис. 2). Ведь гены содержат экзоны (кодирующие участки) и интроны (участки, удаляющиеся в ходе процессинга пре-мРНК). Вполне естественно, что скорости изменения функционально разных последовательностей должны отличаться, поскольку важные для нормального существования организма регионы генома естественным образом окажутся более консервативными, а менее значимые участки будут накапливать изменения интенсивнее.
Рисунок 2. Эволюция представлений о строении гена. а — 30-е годы. Хромосомы — это цепочки из генов. б — 60-е годы. Гены в хромосомах разделены спейсерами и гетерохроматиновыми участками. в — Наши дни. Гены содержат интроны, которые удаляются из пре-мРНК в результате сплайсинга.
Молекулярные часы: множество стрелок и все идут с разной скоростью!
В 80-е годы c накоплением данных о ДНК-последовательностях геномов разных организмов число противоречий относительно методики молекулярных часов возросло. В 1986 году в своей работе Бриттен заключил, что разные группы живых организмов могут накапливать молекулярные изменения с разной скоростью [10]. В частности, он пришел к выводу, что грызуны, а именно мыши и крысы, эволюционировали заметно быстрее, чем прочие группы млекопитающих, а, например, человекообразные обезьяны, наоборот, характеризовались низкой скоростью молекулярной эволюции (нейтральные замены накапливались медленнее). Сам Бриттен склонен был объяснять это тем, что у данных групп могли быть различия в системе репарации ДНК, что и привело к расхождению в скорости накопления нейтральных мутаций. Однако эти исследования показывали, что скорость нуклеотидных замен пропорциональна скорее количеству поколений, сменившихся с момента дивергенции исследуемых таксонов, чем абсолютному времени, прошедшему с тех пор, что усложняло применение метода молекулярных часов в исследованиях, поскольку вносило дополнительные неточности.
Примерно в это же время ученые с короткими фамилиями Ву и Ли сделали предположение о том, что в линиях грызунов и человекообразных обезьян могут по каким-то причинам различаться количества синонимичных (не приводящих к замене аминокислоты и, следовательно, не отражающихся на фенотипе) и несинонимичных нуклеотидных замен [11]. Им даже удалось подтвердить это в своей работе, в которой они показали, что число синонимичных замен у грызунов в два раза больше, чем в линии наших предков. Эти данные подтверждали необходимость сравнивать не абсолютные промежутки времени, а количество поколений, прошедших с момента дивергенции.
Однако эти заключения были подвергнуты сомнению в работе Эстила [12], в которой утверждалось, что причиной расхождений в скоростях накопления мутаций была неверная оценка времени дивергенции общих предков линии грызунов и человекоподобных обезьян. Впрочем, в последующих работах Ли было показано, что есть разница в скорости накопления замен в интронах некоторых генов у обезьян Старого света и их человекоподобных родственников [13].
Сравнение скоростей молекулярной эволюции различных локусов проводилось и на других объектах. В частности, было показано, что ген алкогольдегидрогеназы у гавайских представителей рода Drosophila изменялся заметно быстрее в сравнении с таким же геном у D. pseudoobscura [14]. Или, например, известно, что структурные гены митохондрий по каким-то причинам изменяются заметно медленнее у рыб, чем у млекопитающих [15]. А недавно с помощью молекулярно-филогенитического анализа удалось не только оценить время, прошедшее с момента дивергенции опсинов, отвечающих за зрение в различных таксонах животного мира, но и доказать сам факт возникновения зрения [16], насолив тем самым противникам идеи биологической эволюции, считающим, что возникновение новых функций в процессе естественного отбора невозможно по причине нежизнеспособности переходных форм.
Все эти результаты свидетельствуют о том, что в разработке метода молекулярных часов есть еще множество неразрешенных вопросов. И по сей день не ясно, чем вызывается разница в скорости накопления мутации и каков вклад в этот процесс систем репарации ДНК и внешних воздействий со стороны среды обитания. Также не всегда понятно, какие именно участки ДНК лучше применять в тех или иных исследованиях. Ясно только то, что эта методика может стать очень удобной и действенной по мере накопления большего количества данных о составе последовательностей ДНК разных видов.