Что такое контрольные тестовые штаммы
ЭТАЛОННЫЙ ШТАММ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕГО КАЧЕСТВА
Эталонный тест-штамм– это чистая культура микроорганизма, данного вида, которая имеет характерные физиологические, морфологические и биохимические свойства.
Направления использования эталонных тест-культур микроорганизмов:
• для проверки ростовых свойств питательных сред;
• для валидации методов контроля качества;
• для проверки пригодности методов испытания [1].
Перечень определений, связанных с эталонным штаммом:
Источники контрольных штаммов микроорганизмов.
Эталонные (референтные) штаммы можно получить из следующих международных коллекций:
• Национальный центр государственной коллекции возбудителей бактериальной инфекции III – IV групп патогенности (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича);
• Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ВКПМ;
• Всероссийская коллекция непатогенных микроорганизмов ИБФМБ;
• Американская коллекция типовых культур (АТСС), а также штаммы других национальных и международных коллекций [2].
Хранение контрольных штаммов микроорганизмов
Контрольные штаммы хранят в лиофилизированном состоянии, в замороженном виде, в среде с криопротектором или на среде хранения в условиях и на протяжении сроков, приведенных ниже.
Таблица 1. Хранение контрольных штаммов микроорганизмов
Восстановление контрольных штаммов микроорганизмов
Для получения рабочих культур делают высев из субкультуры референтного образца. Со среды хранения штамм рассевают на плотные неселективные питательные питательные потребности соответствующих микроорганизмов (1 пассаж). Посевы инкубируют в подходящих для роста условиях. При отсутствии роста на плотной среде культуру засевают на соответствующую жидкую питательную среду. После инкубирования делают высев на плотную питательную среду (1 пассаж). Так как микроорганизмы после 1 пассажа обладают пониженной жизнеспособностью, рекомендуется в качестве рабочих культур использовать культуры 2 или 3 пассажа [3].
Проверка культур контрольных штаммов
Выросшую на питательномагаре культуру контрольного штамма визуально проверяют на чистоту роста и отсутствие диссоциации или просматривая под стереоскопическим микроскопом (лупой) в «проходящем свете». При выявлении контаминации или диссоциации следует уничтожить использованную пробирку с субкультурой референтного образца [3].
Методы оценки качества питательных сред
Оценку качества испытуемой среды по микробиологическим критериям проводят с помощью одного из методов:
Выбор метода контроля определяется видами питательных сред и целямиконтроля (чувствительность, специфичность, селективность и т.д.).
Перечень необходимых контрольных штаммов указывается в сертификате на данную коммерческую среду либо указан в приложении к настоящей стандартизованной технологии на основные питательные среды.
• Качественный метод (посев морфологических характеристик роста микроорганизма на исследуемой питательной среде или дифференцирующих свойств питательной среды (для дифференциально-диагностических сред). Для контроля качества дифференциально-диагностических сред необходимо использовать как контрольные штаммы микроорганизмов, дающие положительный результат, так и штаммы, дающие отрицательный результат теста на данной среде.
Микробиологические критерии качества питательной среды
При использовании контрольных штаммов по их росту на испытуемой питательной среде можнотоценить следующие микробиологические критерии качества питательной среды:
• типичность морфологических, культуральных характеристик микроорганизма;
• чувствительность (продуктивность) среды;
• селективность (для селективных сред);
• специфичность, выраженность отличительных признаков различных микроорганизмов для дифференциально-диагностических сред;
• величина зон задержки роста вокруг дисков с антибиотиками для контроля сред и качества дисков с антибиотиками для диско-диффузионного метода определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Интерпретация результатов оценки качества питательной среды
При использовании качественного метода контроля питательных сред оценивается скорость роста, величина колоний, морфология колоний и наличие других признаков, свойственных для контрольного штамма, например, гемолиз, пигмент и т.д.
При оценке качества неселективных количественным методом чувствительность (продуктивность) питательной среды должна составлять не менее 70%. На селективных средах чувствительность среды для целевого микроорганизма должна быть не менее 50-70% (в зависимости от вида среды), а рост нецелевых микроорганизмов должен частично или полностью подавляться.
Поддержание культур контрольных штаммов микроорганизмов
Библиографический список
Бакулов, И.А. Эпизоотология с микробиологией [Текст] / Бакулов И.А. – Москва: Агропромиздат, 1987. – 415 с.
Меньшиков, В.В Стандартизированная технология. Внутрилабораторный контроль качества питательных сред для клинических микробиологических исследований [Текст] / Меньшиков В.В. – Москва: Федерация лабораторной медицины, 2014. – 80 с.
Контроль качества определения чувствительности
При определении чувствительности микроорганизмов к АБП любым методом необходимо выполнять процедуры внутреннего контроля качества исследования.
Достоверность результатов исследования чувствительности микроорганизмов к АБП зависит от следующих основных параметров:
Контроль чистоты роста культуры
Образец инокулюма, использованного для оценки чувствительности необходимо засеять на чашку с неселективной питательной средой и инкубировать в течение ночи. При выявлении на неселективной среде смешанной культуры результаты оценки антибиотикочувствительности не учитывают, исследование необходимо повторить.
Контроль качества питательных сред
Контроль роста
Для контроля роста при определении чувствительности методами разведений (в агаре, в жидкой питательной среде) используют чашки с агаром, пробирки с бульоном или специально выделенные лунки микротитровального планшета, в которые не внесен АБП.
Контроль стерильности
Для контроля стерильности проводят инкубацию при 35 °С в течение 24 или более часов репрезентативного количества чашек с агаром из каждой партии при определении чувствительности ДДМ, чашек с агаром или пробирок с бульоном, не содержащих антибиотиков, при тестировании методом разведений в агаре или макроразведений в бульоне, соответственно. При определении чувствительности методом микроразведений контроль стерильности производится по специально выделенным для этой цели лункам микротитровального планшета, в которые не вносят растворы антибиотиков и микробную взвесь.
Проверка рН агара
В условиях рутинной работы лаборатории допустимо не контролировать рН приготовленного агара, если результаты тестирования контрольных штаммов находятся в необходимых границах. При возникновении проблем с результатами тестирования контрольных штаммов, особенно к АБП, активность которых может существенно изменяться под влиянием рН питательной среды (например, аминогликозиды, макролиды, тетрациклины и др.), необходимо провести определение рН среды после автоклавирования, внесения всех необходимых добавок и охлаждения до комнатной температуры (25 °С). Для достоверного определения рН необходимо использовать рН-метр с поверхностно-активным электродом, другие методы определения рН (с помощью лакмусовой бумаги, обычного рН-метра) не должны использоваться, так как не обеспечивают получения достаточно точных результатов. Приемлемый диапазон рН для питательных сред для определения чувствительности 7,2 – 7,4. При рН среды, выходящей за указанные пределы, возможны существенные отклонения результатов определения чувствительности от должных значений.
Контроль катионного состава
Контроль содержания тимина и тимидина
При определении чувствительности к АБП из группы антагонистов фолиевой кислоты (антифолатов) – сульфаниламидов и триметоприма – критически важным показателем является содержание антагонистов действия этих препаратов – тимина и тимидина в питательной среде. Питательные среды для определения чувствительности к сульфаниламидам и триметоприму должны содержать минимальные концентрации тимидина. О пригодности питательной среды для определения чувствительности к антифолатам можно косвенно судить по результатам тестирования контрольного штамма Enterococcus faecalis ATCC 29212. Среда считается удовлетворительной по качеству при МПК триметоприма/сульфаметоксазола в отношении E.faecalis ATCC 29212 ‹ 0,5/9,5 мг/л и диаметре зоны подавления роста вокруг диска с этим АБП ≥ 20 мм.
Интегральный контроль качества определения чувствительности
Наиболее доступным интегральным методом оценки качества определения чувствительности является сопоставление результатов определения чувствительности (МПК или диаметров зон подавления роста) контрольных (референтных) штаммов микроорганизмов с соответствующими показателями, приведенными в их паспортной характеристике. Тестирование контрольных штаммов проводят в соответствии с описанными выше методами, параллельно тестированию клинических изолятов.
Контрольные (референтные) штаммы микроорганизмов
В качестве контрольных используют штаммы Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), отличающиеся генетической стабильностью и хорошо изученными фенотипическими характеристиками, в том числе и уровнем чувствительности к АБП. Если при исследовании чувствительности к АБП контрольных штаммов получены значения МПК или диаметров зон подавления роста, соответствующие паспортным характеристикам этих штаммов, то это свидетельствует о стандартности условий постановки эксперимента. Результаты определения чувствительности клинических изолятов, полученные в этих условиях, следует признать достоверными.
Выбор референтных штаммов для проведения контроля качества тестирования определяется видом исследуемого микроорганизма. При контроле качества определения чувствительности отдельных групп микроорганизмов необходимо использовать следующие контрольные штаммы:
При детекции отдельных механизмов резистентности (БЛРС, метициллинрезистентности и др.) возникает необходимость использования контрольных штаммов, обладающих указанными механизмами.
Допустимые диапазоны значений МПК и диаметров зон подавления роста для основных контрольных штаммов представлены в таблицах.
Таблица 2.
Таблица 3.
Таблица 4.
Таблица 5.
Хранение контрольных штаммов
В условиях лаборатории штаммы должны храниться таким образом, чтобы возможность мутаций и контаминации культуры была минимальной. Для этого создается банк контрольных штаммов, предназначенный для длительного хранения, а для ежедневной рутинной работы используются регулярно субкультивируемые культуры.
В случае, если «рабочие» контрольные штаммы были контаминированы или результаты определения чувствительности контрольного штамма не попадают в необходимые пределы, и это не может быть объяснено нарушениями методики определения чувствительности, «рабочий» штамм должен быть заменен на свежий из банка контрольных штаммов.
Перед использованием для контроля качества определения чувствительности хранившийся контрольный штамм должен быть дважды субкультивирован на подходящих питательных средах.
Частота проведения контроля качества
Оптимальным является проведение контроля качества определения чувствительности с использованием набора контрольных штаммов ежедневно, параллельно с тестированием клинических изолятов.
В то же время, если при проведении подобного тестирования получаемые результаты окажутся за пределами указанных границ, необходимо вернуться к ежедневному контролю качества для выяснения причины получения неправильных результатов.
Контрольные штаммы микроорганизмов BD Microtrol
Контрольные штаммы микроорганизмов BD Microtrol™ выполнены в виде дисков и предназначены для использования в микробиологических лабораториях для выполнения контрольных испытаний. Они являются первым поколением национальных штаммов микроорганизмов и пригодны для использования в аккредитованных лабораториях для получения рабочих стоковых культур (см. Ограничения). Диски BD Microtrol™ образуются путём лиофильной сушки микробных культур, получаемых исключительно из культур коллекций клеточных банков NCTC (Национальная коллекция типовых культур) и NCPF (Национальная коллекция патогенных грибов). Жизнеспособность микроорганизмов стабилизирована путём добавления активированного угля и силиконового геля.
В каждом диске от 10 6 до 10 9 микроорганизмов.
Диски BD Microtrol™ после их восстановления представляют собой чистые культуры микроорганизмов с известными свойствами, которые используются для следующих целей:
Меры предосторожности и хранение:
Изъятия дисков из флаконов: Диск можно достать из флакона с помощью стерильного пинцета или стерильной микробиологической петли на 10 мкл.
Использование на твердой среде: Поместите диск на подходящую твердую среду. Оставить диск на 10-15 минут для размягчения. Чашка может быть поставлена в инкубатор для ускорения этого процесса. Распределите размягченный диск по поверхности чашки и инкубируйте в подходящих для данного микроорганизма условиях.
Использование в жидкой среде: Внесите диск во флакон с 1-10 мл подходящей питательной средой. Избегая образования аэрозоля, осторожно перемешивайте среду до полного растворения диска и проводите инкубацию в подходящих условиях до получения стоковой культуры.
Можно использовать альтернативный метод, при котором среда с диском для его быстрого растворения помещается в инкубатор на 1 час при температуре 35 – 37 °C и после этого сразу используется. Выбор лучшего способа приготовления стоковой культуры можно подобрать экспериментальным путём.
Ограничения: Повторное использования приготовленной стоковой культуры может привести к изменению ее свойств. Рекомендуется для каждого цикла экспериментов использовать свежий диск.
Меры безопасности и утилизация:
Каталог «BD Промышленная Микробиология» на русском языке.
10. ПРОЦЕДУРА ВЕДЕНИЯ ЭТАЛОННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР
Ведение эталонных культур обеспечивает максимальное сохранение типовых свойств штаммов, что достигается соблюдением принципов их культивирования, контроля и хранения.
Основные принципы ведения эталонных бактериальных культур:
— эталонные штаммы следует получать из официально признанной коллекции микроорганизмов;
— количество пассажей тестового микроорганизма на питательных средах с момента его восстановления до момента его целевого использования должно быть, по возможности, минимальным;
— движение культуры с момента ее восстановления после лиофилизации до целевого использования должно быть однонаправленным, т.е. запасы эталонной культуры не должны пополняться за счет (из) запасов рабочей культуры. Нежелательно пополнять запасы рабочей культуры путем получения ее субкультур;
— контроль эталонного штамма на соответствие паспортным данным и отсутствие диссоциации необходимо проводить перед закладкой на длительное хранение и перед восполнением запасов рабочей культуры;
— штаммы с измененными свойствами для дальнейшей работы не используют;
— для целевого использования пригодны культуры эталонного штамма, прошедшие с момента высева со среды для хранения запасов рабочей культуры не более 2 пассажей.
Данный раздел регламентирует вопросы культивирования, хранения и контроля эталонных культур, которые должны использоваться для обеспечения надлежащего качества исследований в практике лабораторий, выполняющих санитарно-микробиологические исследования воды.
В практике лабораторий, выполняющих санитарно-микробиологические исследования воды, используются следующие эталонные культуры микроорганизмов:
1. E.coli M17-02 как положительный контроль биохимических тестов и отрицательный контроль реактива на оксидазу; для контроля мембранных фильтров; для контроля качества питательных сред по биологическим показателям.
2. Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens как положительный контроль реактива на оксидазу.
3. E.coli К12 F+ Str-r для выполнения анализа на колифаги.
4. Фаг MS2 для контроля способности рабочей культуры E.coli К12 F+ Str-r лизироваться специфическим фагом.
С учетом различной технической и материальной обеспеченности лабораторий возможны два варианта ведения эталонных бактериальных культур:
— без создания запаса эталонной культуры длительного хранения, не требующий специального оснащения;
— с созданием запаса эталонной культуры длительного хранения с применением криоконсервации, который следует рассматривать как оптимальный.
Процесс ведения эталонных культур в данном варианте состоит из следующих блоков:
— восстановление и контроль лиофилизированной культуры;
— восполнение запаса рабочей культуры;
— подготовка культуры для целевого использования;
— контроль видовых и паспортных свойств.
Оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.
Одну пробирку с посевом используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым паспортным свойствам. Второй посев на скошенном питательном агаре используют для создания запасов рабочей культуры.
Культура с измененными свойствами в работу не допускается.
Одну из пробирок с культурой, предназначенной для восполнения рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.
Восполнение запасов рабочей культуры производится в конце третьего, шестого и девятого месяца с момента вскрытия ампулы (каждые 3 месяца).
Один из посевов используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым паспортным свойствам. Второй посев на скошенном питательном агаре используют для восполнения запасов рабочей культуры.
При удовлетворительном прохождении контрольных тестов процедура закладки культуры на хранение осуществляется согласно п. 10.2.2. Восполнение запасов рабочей культуры проводят только 3 раза. По истечении года использования необходимо получить новую эталонную культуру из коллекции микроорганизмов.
Культуру из одной пробирки используют по назначению с предварительной подготовкой согласно методическим документам. Вторая пробирка используется для получения культуры для работы на следующий (второй) день. При необходимости получения культуры тест-штамма на третий день высев снова производят с полужидкого агара.
Процесс ведения штаммов в данном варианте состоит из следующих блоков:
— восстановление и контроль лиофилизированной культуры;
— создание запаса эталонной культуры, хранение в условиях криоконсервации;
— создание запаса рабочей культуры;
— подготовка культуры для целевого использования;
— контроль видовых и паспортных свойств.
В отличие от широко распространенной методики ведения культур микроорганизмов, основанной на неограниченных последовательных (линейных) пересевах, данная схема ведения сводит до минимума количество пассажей эталонной культуры, проводимых от момента восстановления после лиофилизации до целевого использования. Такой подход позволяет сократить вероятность нежелательных мутаций, ведущих к потере эталонных свойств, или случайного загрязнения. Забракованная линия эталонной культуры может быть в любой момент заменена новой.
Приложение 7.3 не приводится.
Восстановление и контроль лиофилизированной культуры проводят, как описано в п. 10.2.1.
Закладку запасов эталонной культуры на длительное хранение осуществляют единожды на весь период ее использования. Запасы эталонной культуры восполнению не подлежат.
Данный блок выполняет задачу накопителя биомассы эталонного штамма, что позволяет избежать необходимости восполнять запасы рабочей культуры за счет повторных пассажей эталонного штамма через питательные среды и удлиняет «срок службы» культуры, полученной из одной ампулы.
Один из посевов на скошенном питательном агаре используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма паспортным (типовым) свойствам. Второй посев используют для создания запасов рабочей культуры.
При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам использование культуры не допускается. В этом случае необходимо разморозить еще одну емкость с эталонной культурой и подвергнуть ее аналогичному исследованию.
Если культура снова не прошла контроль, ее снимают с хранения и в дальнейшем не используют. Необходимо получить новую ампулу с эталонной культурой и начать процедуру ведения тестового штамма сначала.
Запасы рабочей культуры создают 1 раз в 3 месяца, используя для этой цели новую пробирку из запаса эталонной культуры. Повторное замораживание размороженной эталонной культуры запрещается. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.
Подготовку культуры для целевого использования осуществляют, как описано в п. 10.2.4.
Постановка контроля включает:
— оценку степени диссоциации культуры Е.coli M17-02;
— проверку видовых свойств бактериальных культур;
— проверку способности E.coli К12 F+ Str-r лизироваться специфичным фагом MS2;
— проверку культуры E.coli К12 F+ Str-r на однородность и отсутствие загрязнения фагом.
Выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 100 колоний. Проверку тест-штаммов на диссоциацию производят путем визуального просмотра изолированных колоний на чашках в прямом и косонаправленном свете через бинокулярную лупу или микроскоп на малом увеличении.
В R-форме колонии эшерихий более плоские, большего размера, неправильной формы с неровными краями и шероховатой матовой поверхностью.
При наличии диссоциации (по размеру, S-R-диссоциация, др.) подсчитывают количество измененных колоний и общее количество просмотренных колоний. Общее количество просмотренных бактерий не должно быть менее 30. Затем рассчитывают процент диссоциации по формуле:
Если процент диссоциированных колоний превышает 25%, то данная культура не пригодна для дальнейшего использования.
В связи с полиморфизмом колоний для штаммов Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens, а также E.coli К12 F+ Str-r оценка R-S-диссоциации не проводится.
После восстановления лиофилизированной культуры проводится типирование культуры по биохимическим свойствам до вида.
Идентификацию рекомендуется проводить с использованием тест-систем биохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae, разрешенных к применению. При этом следует руководствоваться рекомендациями производителя. Правомочна постановка отдельных биохимических тестов.
Перед очередным ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры оценку эталонного штамма E.coli проводят путем подтверждения следующих основных свойств:
— отсутствие оксидазной активности;
— способности образовывать на среде Эндо характерные темно-красные (малиновые) колонии с металлическим блеском и отпечатком на среде;
— способность утилизировать глюкозу до кислоты и газа при температуре 37 °C в течение 24 часов.
Если культура не соответствует видовым свойствам или выявлено наличие посторонних микроорганизмов, то она не пригодна для дальнейшего использования.
Способность E.coli К12 F+ Str-r лизироваться специфичным фагом, являющимся основополагающим свойством тест-культуры, на котором основан метод определения колифагов в воде.
Контроль чувствительности E.coli К12 F+ Str-r к фагу осуществляется каждый раз, когда из запасов хранения берется новая пробирка с рабочей культурой на полужидком агаре.
Культура считается восприимчивой и пригодной для проведения анализов воды при наличии четких зон лизиса.
При отсутствии зон лизиса культура не пригодна для использования и подлежит замене.
Посевы просматривают в проходящем свете. Культура должна давать равномерный газон роста. Наличие зон лизиса в контроле свидетельствует о загрязненности культуры фагами.
Загрязненная культура не пригодна для дальнейшего использования.
Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens проводят путем подтверждения следующих свойств:
— наличия оксидазной активности;
— роста на ПБ в виде серебристой пленки на поверхности с образованием кольца сине-зеленого пигмента;
— наличия сине-зеленого пигмента пиоцианина при росте на ПА при 37 °C;
— способности роста на питательном агаре при 42 °C в течение 24 часов (для Pseudomonas aeruginosa);
— способности роста на питательном агаре при 4 °C в течение 24 часов (для Pseudomonas fluorescens) либо при температурном оптимуме, указанном в паспорте.
Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.
В качестве эталонного штамма для проведения контроля культуры клеток хозяина при проведении анализа на колифаги используется РНК-содержащий фаг MS2.
Процесс ведения эталонного штамма колифага MS2 состоит из 2 функциональных блоков:
— восстановление лиофилизированной культуры;
— создание запасов эталонной культуры и культуры для целевого использования.
Оттянутый конец ампулы с лиофилизированными культурами нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины.
Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.
= 0,5 мл питательного бульона для регидратации.
Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят в стерильные пробирки, добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.
Одну пробирку используют для целевого назначения в контроле чувствительности культуры E.coli К12 F+ Str-r к фагу согласно п. 10.4.3. Две другие служат запасом эталонного фага.
Активность полученной культуры определяется титром фага. Через год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо получить новую культуру или провести определение титра хранящегося фага.
Для определения титра фага выполняется серия десятикратных разведений хранящейся бульонной суспензии эталонного фага, как описано в разделе 9.
При получении титра менее 10(7) фаг можно размножить. Для нарастания титра необходимо повторить описанную процедуру.
После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести тщательную обработку помещения дезсредствами и обеззараживания ультрафиолетовым излучением.
Раздел составлен на основе:
бактериологического контроля питательных сред.
Методические рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и больниц. Хабаровск, 1979;
Методических рекомендаций к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980;
ФС 42-3588-98. Питательная среда для выделения сальмонелл сухая (висмут-сульфит агар), срок действия до 15.10.03;
сборника инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов. Утв. Приказом МЗ СССР N 31 от 13.01.83;
Руководства по аккредитации для лабораторий, производящих микробиологическое тестирование;